Tubedown-1 与眼部新生血管性疾病

秦秀虹，范松涛，张珍珍，卢建民，张晨曦

(1. 大连医科大学 附属第一医院 眼科，辽宁 大连116011;2.上海交通大学 附属上海市第一人民医院 眼科，上海200080)

Tubedown-1 是最早在2000年由Gendron 等［1］发现的，是从胚胎内皮细胞丛(embryonic endothelial cells，IEM)分离出来的一种新的N-末端乙酰转移酶(N-terminal acetyltransterases，NATs)，其分子量为69 kD，为包含594 个氨基酸的亲水蛋白质。Tubedown-1 主要存在于发育的卵黄囊血岛、心脏、肝脏血管的内皮细胞和造血细胞;成人的心房内膜、卵黄囊血管、骨髓的血管内皮细胞及骨髓腔的造血组织以及闭锁卵泡血管床，在正常成人眼中主要分布于角膜缘血管、视网膜脉络膜血管内皮中［1］。Tubedown-1 亦被称为Narg1(NMDA receptor -regulated protein 1)或mNat1(menage a trois 1)，能够抑制血管过度增生及渗漏而保护视网膜正常功能［2］。目前研究表明其对眼部脉管系统的发育及缺氧状态下视网膜新生血管形成及发展分别有调控及抑制作用，现介绍tubedown -1 的特性及在脉管系统发育中的作用及与眼科疾病的关系及相关进展。

1 Tubedown-1 的基本结构及乙酰化作用

Tubedown - 1 是酵母菌NAT1(N - terminal acetyltransterase，NAT1)氨基末端乙酰转移酶的同源异型体，Gendron 等［1］的研究揭示了大部分tubedown-1 序列与啤酒酵母NAT1 相一致(28%相同，4 7% 的阳性氨基酸置换率)。啤酒酵母包含3种NATs:NATA、NATB 和NATC。NATA 同时需要催化亚基Ard1p(arrest defective 1 protein)和调节亚基Nat1p(N α –terminal acetyltransferase subunit)才能发挥活性，具有乙酰化含丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸或苏氨酸末端蛋白质的功能［3］。在真核生物，Nat1p同系物蛋白质涉及几个关键生物学现象，如组织发育、细胞增殖、癌症。NATB 包括催化亚基NAT3p［4］和调节亚基Mdm20p，也是NATB 活性所必须的，能乙酰化蛋氨酸-谷氨酸或蛋氨酸-天冬氨酸末端蛋白质以及蛋氨酸-天门冬氨酸和蛋氨酸-蛋氨酸蛋白亚类，NATB 乙酰化酵母菌2 个基本的蛋白质，即肌动蛋白和肌凝蛋白。NATC 包括Mak3p、Mak10和Mak31p 3 个亚基，3 种亚基均是NATC 活性所必需，NATC 乙酰化含有蛋氨酸-异亮氨酸、蛋氨酸-亮氨酸、蛋氨酸-色氨酸或蛋氨酸-苯丙氨酸的蛋白质［5］。

氮末端乙酰化是真核生物最普通蛋白修饰之一，出现在大约80% ～90%的不同种类的细胞溶质蛋白，50%的酵母蛋白，是一种不可逆的酶催化反应，即氮末端残基，例如丝氨酸残基、丙氨酸残基、蛋氨酸残基等接受乙酰CoA 乙酰基。乙酰化修饰中和了正电荷，这些正电荷能影响蛋白质功能、稳定性、与其他分子的相互作用或其他后来的修饰，如磷酸化［5-6］。这个反应是由一系列乙酰转移酶催化的，在原核生物、古细菌、真核生物等所有领域中均发现这些乙酰转移酶。研究表明，tubedown -1 与NAT1 同源性包括一个与乙酰CoA 同源的NAT1 区域，这个乙酰CoA 能结合组蛋白去乙酰基转移酶(GCN5)家族乙酰转移酶序列［1］，证明tubedown -1与NAT1 氨基末端乙酰转移酶同源，并通过对其他蛋白质的乙酰化修饰而产生作用的。

2 Tubedown-1 的表达分布与胚胎发育

Tubedown-1 在组织发育过程中的内皮细胞和造血细胞中均受到调节，例如在卵黄囊血岛、心脏、肝脏血管的内皮细胞和造血细胞;在成人，除了心房内膜、卵黄囊血管、骨髓的血管内皮细胞及骨髓腔的造血组织以及闭锁卵泡血管床，tubedown-1 在大多数器官低表达或不表达。而Tubedown-1 在正常成人眼中主要分布于角膜缘血管、视网膜脉络膜血管内皮中，在周细胞中无表达或仅有少量表达［1］。

Tubedown-1 表达水平的分布在胚胎发育过程中是不断变化的。Tubedown-1 的表达在大多数血管发育的早期至中期达到高峰，并在成熟晚期水平下调，表明其可能参与胚胎发生过程中血管成熟阶段的调节，有研究表明，tubedown -1 在早期卵黄囊脉管系统形成过程中表达最高，在卵黄脉管系统血管发生的发育晚期则下调［1］，证明了这个观点。Gendron 等［1］在体外实验中发现，tubedown -1 在未受刺激的IEM 细胞中呈高表达，当IEM 细胞受到碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)刺激形成毛细血管管状结构时，其表达水平下调。Tubedown-1 的分布与表达调节的研究提示这个新的乙酰转移酶可能参与了血管调节、造血发生以及生理血管发生的过程。

同时有学者发现小鼠玻璃体血管表现为转化生长因子-β2(transforming growth factor -β2 TGF -β2)的定向失活，并呈现出类似于人永久性胚胎血管的病理改变，即玻璃体无法塑型并有异常结构残留。在研究正常发育的玻璃体脉管系统及TGF -β2 - / -小鼠眼的玻璃体血管的tubedown -1 表达过程中，发现TGF -β2 - / -小鼠眼玻璃体血管内皮细胞核表达增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)并显示出活化的促分裂原活化蛋白激酶磷光体-P42/44MAPK(P42/44)表达增高，同时表达4 型胶原，TGF-β2 - / -小鼠玻璃体血管结构紊乱，提示血管结构破坏和血管基片分解。此外，TGF-β2 - / -小鼠玻璃体血管缺乏周细胞标记(CD13，α 平滑肌肌动蛋白)的表达，并显示了其超微结构的改变与周细胞变性相一致。当维持内皮细胞标记血管假性血友病因子(von willebrand factor，vWF)的表达时，TGF -β2 - / -小鼠玻璃体血管积聚，而tubedown -1 表达的显著下降［7］，说明tubedown-1 能抑制体外毛细血管样结构形成，并且能在发育中的玻璃体血管退化之前延缓玻璃体血管的形成。因此，tubedown - 1 可能参与调节TGF -β2 - / -的正常玻璃体脉管系统的发育，并与玻璃体胚胎发育血管的生长调控相关。

3 Tubedown-1 在维持血管内环境稳态中的作用

在研究tubedown-1 维持血管内环境稳态的过程中，Paradis H 等［8］研究了tubedown -1 蛋白复合物的自然特性，确定并揭示了tubedown -1 与皮层肌动蛋白及细胞骨架蛋白F-actin 共同位于细胞浆及所培养的内皮细胞核内，皮层肌动蛋白被认为能与F-actin 相互作用，调节内皮细胞渗透性而维持内皮细胞内稳态。将内皮细胞的tubedown -1 敲除后将导致Ard1 蛋白表达被抑制，显著增加细胞渗透性。Gendron 等［9］研究了胡瓜鱼眼组织对渗透压的适应，胡瓜鱼把自身的渗透压变成与周围海水几乎相同来御寒。研究人员发现玻璃体液温度在0.5 ℃以下的胡瓜鱼其甘油及渗透压较玻璃体温度在8 ～10 ℃者显著增加;与8 ～10 ℃物种相比，0.5 ℃以下的胡瓜鱼小动静脉网及脉络膜血管内皮细胞连接区域tubedown -1 蛋白表达水平显著增加，认为tubedown-1 蛋白的变化能够调节眼内液体和血浆之间的蛋白通路。这些实验均说明tubedown -1 在血管中的渗透活性对维持血管稳态至关重要。

4 Tubedown-1 与眼新生血管

与眼新生血管有关的疾病能引起视力丧失和致盲。其中糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是能引起眼部新生血管的疾病之一，并以视网膜微血管渐进性改变为特征，最终进展为视网膜无灌注、渗透性增强以及视网膜血管的病理性增殖［10］。目前，高水平的血管源性因子被认为是导致血管增生的原因。一些血管源性生长因子，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、bFGF、胰岛素样生长因子-1(insulin -like growth factors-1，IGF-1)等，以及细胞粘附分子和细胞外基质成分均能导致PDR(proliferative diabetic retinopathy，PDR)病理性新生血管形成［11］，而tubedown-1 是近年新发现的能抑制眼底新生血管形成相关的细胞因子。

Tubedown-1 于成人大多数血管未见表达，但在眼内血管则持续表达;在内环境稳态情况下，tubedown-1 于正常成人眼内血管呈高水平表达。Gendron 等［1］以体外生长的脉络膜视网膜内皮毛细血管丛为模型，应用免疫印迹和免疫组化方法研究成人体内稳态情况下正常人视网膜组织中tubedown-1 的表达，发现tubedown -1 高表达于正常人视网膜血管内皮。国外研究表明tubedown -1亦表达于猕猴脉络膜视网膜来源的内皮细胞丛，并且，当这些内皮细胞丛生长为毛细血管样结构时，则tubedown-1 表达下调［11］，这些证据表明tubedown-1的表达可能参与维持眼血管稳态，因此推测tubedown-1 具有延缓正常视网膜毛细血管生长的作用。然而，在PDR 形成新生血管时，tubedown -1表达被抑制，其延缓正常视网膜毛细血管生长的作用被消除，最终导致糖尿病患者视网膜新生血管形成。Wall DS 等［12］应用条件性敲除血管内皮细胞tubedown-1 小鼠模型，研究小鼠视网膜血管内皮中tubedown-1 表达，发现tubedown -1 基因敲除小鼠所表现出的视网膜和脉络膜新生血管形成、视网膜前膜、视网膜内纤维血管损伤与增殖型视网膜病变相似。Tubedown-1 基因敲除小鼠的视网膜形态学特征是视网膜前膜形成，包括视网膜新生血管，纤维血管增殖，视网膜晶状体粘附等;tubedown -1 基因的敲除不仅导致视网膜结构、类型异常，还增加了视网膜异常血管及毛细血管的数量;其视网膜损伤严重程度及视网膜和脉络膜组织厚度随着tubedown -1 抑制时间的延长而增加［12］，这些结果说明tubedown-1 表达于正常视网膜内皮细胞，但是在PDR病人的视网膜内皮细胞，其表达被特异地抑制，提示tubedown-1 的持续表达对视网膜血管内环境稳态和抑制成人视网膜新生血管形成至关重要，进一步说明tubedown-1 可能是一种新的血管生成抑制因子，能抑制病理情况下视网膜新生血管的生成，其表达缺失能促进新生血管的增殖。

另外，还有学者研究发现tubedown -1 在氧诱导的视网膜新生血管形成的小鼠模型和第3 期的人未成熟儿视网膜病变(retinopathy of prematurity，ROP)样本中表达受到抑制;tubedown -1 在高氧诱导的小鼠视网膜病变的增殖性视网膜血管中表达明显降低，并伴随血管肌成纤维细胞标记抗平滑肌抗体(anti - smooth muscle antibodym，ASMA)及增殖的细胞标记PCNA 表达增加，这些结果说明此模型中视网膜血管内皮中tubedown -1 的表达抑制与增殖的细胞核抗原和平滑肌肌动蛋白表达增加相关联，而ASMA 被认为参与了视网膜损伤形成，具有收缩力导致视网膜脱离，说明tubedown -1 可能通过抑制ASMA 抑制视网膜损伤。而tubedown -1 蛋白在人ROP 的3 期样本的玻璃体新生血管无表达［13］，表明tubedown-1 的表达可能在ROP 病理过程被抑制，由此可见tubedown -1 在视网膜内皮细胞表达抑制可能是ROP 视网膜血管增殖的促进因素，进一步说明tubedown -1 是一种新生血管抑制因子，能抑制病理性新生血管的增殖，其缺失或表达下降均能引起血管增殖性疾病的发生。

Gendron 等［2］建立了内皮细胞tubedown -1 基因敲除小鼠模型，并与成年小鼠及人进行比较，发现眼内后极部内皮细胞tubedown -1 的表达随年龄增加而逐渐减少，并与老年小鼠脉络膜和视网膜组织的病理性改变相关。在人类，无眼底病变的老年人其tubedown-1 在视网膜和脉络膜的表达较青年人轻度降低。然而，在老年性黄斑变性(age related macular degeneration，AMD)患者的脉络膜血管中tubedown-1 表达显著降低。在tubedown -1 敲除眼视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)细胞和Bruch’s 膜以及脉络膜毛细血管的超微异常变化同样发生于AMD 患者，说明随着年龄的增长，视网膜和脉络膜血管中tubedown -1 表达显著降低可能参与了AMD 病理的发生与发展，而AMD 是一种黄斑区新生血管增生性病变，同样证明了tubedown-1 可能是一种新生血管抑制因子，抑制病理性新生血管的增殖。

此外，有学者发现正常成人血管中tubedown -1的表达与视网膜色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)的表达相平行［14］。PEDF是一种抗血管生成的丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员，由正常的视网膜色素上皮产生，在氧诱导的小鼠和大鼠的视网膜新生血管形成时可见PEDF 的表达水平降低，给予缺血诱导的视网膜病变小鼠PEDF能预防tubedown-1 基因敲除小鼠视网膜新生血管形成［15］。在人PDR 视网膜组织中是否存在PEDF的表达下降及在这个时期tubedown -1 是否能直接或间接地被PEDF 调节尚不清楚，还有待进一步研究。

因此，tubedown-1 是一种血管生长抑制因子，能抑制眼部疾病新生血管的形成。

5 Tubedown-1 导致血管增殖的机制

Tubedown-1 缺失能导致视网膜血管增殖的机制包括:(1)影响涉及通过乙酰化作用调节血管生成的蛋白质稳定性和活性。乙酰转移酶Ard1 能结合NAT1 同系物tubedown-1，并在哺乳动物缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor -1α，HIF -1α)的定向降解中起作用［16］。HIF-1α 在低氧情况下调节VEGF 表达，并能通过对VEGF 诱导促进血管增殖［17］。一个或多个乙酰转移酶复合物结合配体受到抑制或缺失可能分解和改变复合物活性。乙酰转移酶复合物的分解涉及Ard1 或tubedown -1能促进HIF-1α 的稳定及细胞因子产物，能促进视网膜新生血管形成。(2)视网膜血管乙酰肝素糖蛋白(heparansulfateproteogly cans，HSPG)表达的下调。Tubedown-1 是视网膜血管基底膜HSPG 表达的上游调节因子，因为tubedown -1 表达的抑制导致来源于视网膜血管基底膜HSPG 的丢失。尽人皆知，血管基底膜的增厚和改变与增殖性视网膜病变有关。基底膜(basement membrane，ECM)组成在内皮细胞和其下的结缔组织之间提供了一个组织特异的屏障，并参与控制血管发生。基底膜成分的变化能促进血管基底膜的破坏和分解，最终导致内皮细胞增殖。基底膜HSPG 的丢失伴随糖尿病视网膜病变血管的瓦解。并且，糖尿病大鼠视网膜显示了HSPG 基底膜蛋白多糖的合成和表达降低［18］。通过了解tubedown-1 作用的相关机制及途径，就有望建立治疗视网膜新生血管疾病的新方法。

6 结 语

综上所述，tubedown-1 在眼脉管系统的发育的调控、维持视网膜血管的稳态及对视网膜新生血管的抑制有重要作用，是一种新生血管抑制因子。新生血管的形成是受多种因素共同调控的，tubedown-1是其中之一，虽然仅针对一种因子进行治疗，不能完全控制新生血管疾病的病变，但可以延缓病变的发展和恶化，tubedown-1 蛋白的表达和或活性的恢复能为治疗增殖性视网膜病变提供一个新的方法。目前对tubedown-1 的性质及作用的了解还所知甚少，其在眼新生血管化及发育的调控的具体作用机制、以及其与其他生长因子如PEDF、VEGF 等的关系还有待于进一步深入研究。

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