microRNA在预防医学中的研究进展

张迎建，李文超，杨红

(东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，江苏南京 210009)

microRNA(miRNA)是一类长度约为22个碱基的微小RNA，能够在转录后水平上调节蛋白质的翻译。它具有高度保守序列，不编码蛋白质，但是能够通过与靶mRNA的碱基互补配对起作用使其降解或抑制其表达，从而导致特定基因的沉默［1］。一般来说，一个miRNA可以调节几十个至上百个基因。据推测，人类约有三分之一基因编码的mRNA受到miRNA的负调控，在生物体的生殖发育和新陈代谢的各个方面均起到调控作用［2-4］。miRNA芯片作为基因组学中新的研究技术为预防医学研究提供了新的手段。在预防医学研究中，运用miRNA芯片、测序以及生物信息学技术可阐明环境有害因素的致病机制，而且miRNA作为已知特定环境因素的致病易感基因和一种新的生物标志物，为有效保护易感人群和疾病的早期诊断、治疗及预防带来了新的希望［5］。

1 miRNA概述

1993 年和 2000 年，Lee 等［6］和 Reinhart等［7］相继在秀丽新小杆线虫发育过程的研究中发现了一种定时调控胚胎后期发育的miRNA-lin4以及let-7，它们的转录产物中有一个长度22 nt的非编码RNA，lin-4、let-7及其特异靶标翻译抑制的发现暗示了发育中基因调控的新机制。近几年又在哺乳动物、鱼、蝇和线虫中鉴定了数百种miRNA。miRNA的合成主要分为细胞核和细胞质两个部分。在细胞核中，编码miRNA的基因首先转录成初级转录本，即pri-miRNA，它在一种核酸内切酶Ⅲ及其辅助因子的作用下剪切为miRNA前体，即pre-miRNA［8-9］。然后，pre-miRNA 通过与核质/细胞质转运蛋白Exportin 5结合将其转运到细胞质中，在细胞质中的第二个核酸内切酶ⅢDicer和TRBP复合物的作用下把miRNA前体剪切成双链miRNA［10-11］。最后，双链miRNA双螺旋解旋，其中的1条结合至RNA诱导沉默复合体上，在其引导下，miRNA与靶mRNA的碱基互补配对，发挥其对基因的表达调控作用［12］。

关于miRNA的作用机制目前主要有翻译起始抑制、翻译起始后抑制、mRNA降解、P小体和SG颗粒扣押靶mRNA［13］等几种观点，主要表现为两个方面:mRNA的降解和翻译抑制。mRNA的特性决定其沉默方式，当它与miRNA不完全互补配对时，仅在某个位点与miRNA互补，那么RNA诱导沉默复合体就不会特异地降解mRNA，只是阻止mRNA作为翻译的模板而不能合成蛋白质，会抑制翻译的过程，这种机制多见于动物中;如果它与 miRNA完全互补配对时，该mRNA就会被RNA诱导沉默复合体特异地剪切或降解，这种机制多见于植物中［14-16］。

2 miRNA在预防医学中的研究进展

2.1 miRNA与毒理学

2.1.1 miRNA与职业毒理学 镍化合物是人类呼吸道的确认致癌物，为了探讨 PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)基因与miR-22在致癌过程中的相互关系，刘林华等［17］以结晶型硫化镍(NiS)诱导转化人支气管上皮细胞第35代(16HBE-T35)及其前期第18代细胞(16HBE-T18)，检测miR-22成熟体表达量和蛋白表达量，发现miR-22的表达在细胞转化的不同阶段呈现不同的特征，提示NiS诱导的恶变细胞中，miR-22可能对PTEN产生反向调控作用，鉴于PTEN在mRNA水平上表达未改变，作者推测miR-22是在转录后水平影响PTEN蛋白的表达。代慧等［18］在细胞水平探讨铬Cr(VI)诱导的L02肝细胞氧化应激状态及miRNA谱系的改变，结果发现 Cr(VI)浓度为 5 μmol·L－1时，各时间点细胞存活率均接近70%，且在染毒8 h细胞ROS相对荧光强度达峰值169.2%，此时 miR-370、miR-let-7和 miR-125b的表达上调，miR-122和miR-137的表达下调，而miR-298和miR-153表达差异无统计学意义，提示Cr(VI)可激发肝细胞明显的氧化应激，并在氧化应激的高峰期诱导L02肝细胞出现特征性的miRNA表达谱。

蔡凤霞等［19］和李煌元等［20］分别研究了锰和百草枯(paraquat，PQ)对大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12)毒性作用以及对miR-133b表达的影响。蔡凤霞等［19］观察到300、600 μmol·L－1MnCl2染毒 PC12 细胞 72 h后，活性氧生成水平高于对照组，300 μmol·L－1MnCl2染毒组PC12细胞相对表达水平上调，提示MnCl2可诱导PC12细胞活性氧生成量升高以及miR-133b的表达上调，但PC12细胞miR-133b的表达与MnCl2染毒浓度之间无剂量-效应关系。李煌元等［20］分别以 0、50、100、300 μmol·L－1PQ 染毒 PC12 细胞24 h 后，发现 100、300 μmol·L－1染毒组细胞存活率下降，细胞凋亡率升高，300 μmol·L－1PQ 染毒组细胞miR-133b表达上调，表明PQ致PC12细胞损害和细胞凋亡时miR-133b的表达上调，miR-133b可能在PQ的神经毒性作用中发挥一定作用。

Wang等［21］评估了氟虫腈、三唑磷和它们的复配剂原药及其微乳剂经口染毒斑马鱼96 h后鱼组织中miRNA的表达，结果表明三唑磷和氟虫腈的原药和微乳剂对斑马鱼组织中miRNA表达的影响不同，虽然三唑磷与氟虫腈的联合杀虫作用是相加的，但三唑磷、氟虫腈致斑马鱼组织中miRNA的差异表达与它们的复配剂间无重叠，提示miRNA可以作为农药毒性作用的生物标志物。在另一项有关三唑磷和氟虫腈引起斑马鱼miRNA表达组织特异性的实验研究中，张羽等［22］发现，三唑磷、氟虫腈、助剂及复配剂对斑马鱼miR-21、miR-128、miR-155和miR-181a的表达影响存在组织特异性，该结果为miRNA的功能研究和农药作用部位定位及作用方式的研究指出了可能的方向。Zhang等［23］报道了miRNAs在黑索今炸药即环三次甲基三硝基胺(RDX)诱导神经毒性中的作用，发现许多miRNA表达有组织特异性，脑组织中上调表达的7个miRNAs(let-7e、miR-98、miR-361、miR-26b、miR-125a-5p、let-7i和let-7f)在肝组织中下调表达，相反肝组织中上调表达的另外7个miRNAs(miR-126-3p、miR-23b、miR-27a、miR-29a、miR-29c、miR-451 和 miR-690)在脑组织中表达下调，经RDX染毒miR-206的表达增加了26倍。此外与癌症发生相关的miRNAs亦有异常表达，如 let-7、miR-17-92、miR-10b、miR-15、miR-16、miR-26和miR-181，提示这些miRNA可能与RDX的致癌性有关。

综上所述，在职业毒理学中，重金属、农药等多种职业有害毒物可引起活性氧水平、氧化应激、细胞凋亡及蛋白表达等改变，而miRNA参与疾病发生的各个环节，提示可作为疾病发生发展的生物标志物。

2.1.2 miRNA与环境毒理学 苯并(a)芘(B［a］P)是导致肺癌的最重要的因素之一。段慧涵等［24］以1.00 μmol·L－1的 B［a］P 染毒原代培养小鼠支气管上皮细胞12、24及48 h后，染毒小鼠支气管上皮细胞的miR-320表达水平上调且呈现明显的时间依赖关系，提示miR-320可以通过对细胞周期素依赖性激酶6表达的调控影响B［a］P暴露细胞的细胞周期。在B［a］P 的代谢终致癌物反式-7，8-二羟-9，10-环氧苯并芘(anti-BPDE)诱导的恶变细胞中有多种miRNA表达的异常改变。刘林华等［25］通过B［a］P的代谢物anti-BPDE诱导的恶性转化第30代人支气管上皮细胞(16HBE-T30)及其前期第15代细胞(16HBE-T15)模型，发现在16HBE-T30细胞中miR-494、miR-22的表达上调，而PTEN蛋白表达下调，在16HBE-T15细胞中上述两种miRNA的表达水平下调;表明anti-BPDE恶性转化细胞中的miR-494和miR-22在转录后水平对PTEN进行反向表达调节，阻止细胞凋亡，增加细胞集落形成率和恶性程度，具有类癌基因的功能，在B［a］P的致癌作用中发挥重要作用。吴延等［26］研究发现，转染前16HBE-T30中miR-17-5p的表达水平上调，转染后转染miR-17-5p抑制剂组的miR-17-5p表达水平下调，与抑制剂阴性对照组相比，细胞增殖活力下降、细胞周期阻滞、凋亡率上升及克隆形成率下降;转染miR-17-5p模拟物组中细胞的miR-17-5p表达水平上调，其增殖活力增加、凋亡率降低、克隆形成率升高。李仲杰［27］关于 miRNAs参与7，8-二氢二醇-9，10-环氧苯并(a)芘诱发的FL细胞应答反应的研究证实，miRNA参与anti-BPDE引起的FL人羊膜上皮细胞早期应答反应，miR-509-5p是FL细胞对BPDE暴露早期应答的一个分子标志物，CDCI4B、DOCK4等7个靶基因受miR-509-5p的转录后调节。张艳秋等［28］予小鼠经口灌胃50 mg·kg－1B［a］P，结果发现与对照组(等量橄榄油)比较，B［a］P染毒组小鼠肺组织中共有差异表达miRNA 109个，其中表达水平上调的miRNA 50个，表达水平下调的59个，TargetScan、miRanda以及picTar软件靶基因预测显示，其中下调较为明显的miR-20b可能是通过调节细胞增殖、周期等相关的蛋白参与调控B［a］P介导的细胞和机体损伤过程。作者指出miRNA对于B［a］P暴露可以产生特异性的表达改变，而且差异表达的miRNA可能在B［a］P导致机体损害过程中起着重要作用。

硫代硫酸钠(sodium thiosulfate，STS)是广泛应用于食品加工业、造纸业、感光工业、染料制造和医药工业的一种硫的衍生物。Hu等［29］将斑马鱼胚胎分别用1 ×10－6～1 mol·L－1的 STS 溶液染毒，结果显示0.1 ～1 mol·L－1STS染毒的斑马鱼胚胎呈现出严重的发育迟缓，并伴随多脏器畸形;利用LNA修饰的miRNAs探针行胚胎整体原位杂交结果显示，miR-124a和miR-133a呈现差异表达。提示硫的衍生物诱发斑马鱼胚胎畸形过程中的一个重要分子事件是神经系统miRNAs表达降低，其致畸的分子机制可能是miRNAs与其靶基因或对其靶基因上游区之间的相互作用。在一项有关环境中纳米材料对植物影响的研究中，Burklew等［30］将灭菌的成熟烟草种子分别暴露于0%、0.1%、0.5%和1%的三氧化二铝纳米粒子中，在室温下培养3周后发现，随着三氧化二铝纳米粒子浓度的增加，烟草幼苗的平均根长、叶数、生物量减少。经RT-qPCR检测发现:在暴露于0.1%的氧化铝纳米粒子的烟草幼苗中，除了miR-156、miR-157和miR-172表达水平上调外，其他的miRNA的表达水平都是下调的;在所有表达水平上调的miRNA中，暴露于1%的氧化铝纳米粒子的幼苗中的miR395、miR397、miR398和miR399的表达水平差异倍数最大。研究表明三氧化二铝纳米粒子影响烟草幼苗的生长和发育，作者推测miRNA可能在纳米三氧化二铝对烟草幼苗的应激反应中起着重要的调控作用。

在环境毒理学中，应用细胞、小鼠、大鼠、斑马鱼、植物等不同的模式生物探讨环境有害毒物对生物体的影响过程中，miRNA参细胞周期的调控，细胞凋亡，影响生物的生长和发育，提示差异表达的miRNA可能在导致生物体损害过程中起着重要作用。

2.1.3 miRNA与食品毒理学 黄曲霉毒素 B1(AFB1)是人类原发性肝癌的主要致病因素之一，AFB1诱导肝癌发生的机制尚不明了。李志芳等［31］利用miRNA芯片技术检测其miRNA表达谱发现，L02和L02T两组细胞中差异表达的miRNA有25个，对其中表达水平上调显著的miR-638进行靶基因预测，筛选到4个与癌症发生发展相关的潜在靶基因。研究提示差异表达的miRNA可能在细胞的恶性转化过程中起着重要作用，具有类似癌基因或者抑癌基因的作用。而在另一项相似研究中，罗晓婷［32］发现差异表达的miRNA有8个，上调基因中差异较显著的是hsa-miR-671-5p，下调基因中差异较显著的是hsa-miR-96，它们与蛋白合成、免疫系统、细胞生理功能密切相关。研究表明AFB1可以引起恶性转化L02细胞中miRNA表达谱的改变。连俊伟［33］探讨了miRNA在AFB1致大鼠急性毒性作用中的作用机制，研究表明AFB1对大鼠有毒性作用，可诱导机体的miRNA异常表达，其中miR-34a可以抑制细胞的生长，可能在AFB1致毒通路中起作用。

丙烯酰胺(ACR)是富含碳水化合物和氨基酸的食品在高温加热下发生美拉德反应产生的，其对人体存在潜在的危害作用。王菊等［34］以10 mmol·L－1浓度的ACR处理受精后6h(6hpf hours past fertilization)的斑马鱼胚胎后发现，染毒ACR组出现多系统的畸形。用核苷酸锁定(LNA locked nucleic acid)标记的miRNA探针进行胚胎6 hpf染毒后整体原位杂交(72 hpf)，结果表明调节斑马鱼神经系统发育的miR-124、miR-125b、miR-9、miR-21、miR-140、miR-206等表达水平上调，调节肌肉心脏发育的miR-1、miR-133a表达水平下调，提示ACR会影响斑马鱼胚胎发育过程中miRNA的表达。

大脑对酒精非常敏感。Sathyan等［35］研究发现，酒精浓度在醉酒水平(69.57 mmol·L－1)可显著抑制胎龄12.5 d胎鼠大脑皮层神经细胞的miR-21、miR-335、miR-9和miR-153 4种miRNAs;而在生活中饮酒经常会达到的酒精浓度(13.04 mmol)却可诱导miR-335表达增加。Sathyan等进一步验证GABAAR受体拮抗剂——印防己毒素可拮抗酒精对miR-21表达的抑制作用，但对酒精抑制miR-335表达无拮抗作用。表明酒精可通过GABAAR受体依赖的机制抑制miR-21表达，通过非GABAAR受体依赖的机制抑制miR-335表达。采用反义RNA抑制miR-21表达可致细胞凋亡，提示miR-21是一种神经细胞凋亡抑制因子。相反，敲除miR-335则在促进细胞增殖同时预防因miR-21抑制而引起的死亡，说明miR-335在功能上是miR-21的拮抗剂，由此解释了酒精处理的神经细胞能够抗凋亡的原因。

综上所述，miRNA在食源性疾病的发生过程中起了很重要的作用，ACR会影响斑马鱼胚胎发育过程中miRNA的表达，AFB1可诱使机体的miRNA发生异常表达，酒精可诱导miR-335表达增加等。

2.1.4 miRNA与放射毒理学 胡铮和冯先武等［36-37］对电离辐射诱导miRNA表达的研究进展作了综述，指出miRNA可以参与细胞辐射敏感性的调节;miRNA可能在辐射诱导旁观者效应中发挥作用以及辐射诱导miRNA的表达变化具有性别特异性;电离辐射可以引起细胞周期阻滞、凋亡、纤维化、致癌等一系列生物反应，能在不同的组织和细胞中诱导miRNA的表达，而且辐射诱导miRNA的表达多依赖辐射剂量和照射时间等因素。近来孙秀锦［38］采用浓度分别为1.85×107、5.55 ×107和16.65 ×107Bq·ml－1的氚水内照射小鼠建立模型，高低剂量组于染毒后10 d处死，中剂量组分别于染毒后 2、4、6、10、28 d 处死，采用 miRNA芯片技术筛选miRNA差异表达改变发现:与对照组比较，初始注入量同为5.55×105Bq·g－1，分别染毒2 d及10 d的小鼠肝脏组织miRNA表达不同，其中表达均上调的miRNA有4个，表达均下调的miRNA有3个;初始注入量5.55×105Bq·g－1，染毒2 d时共有41个miRNA发生了差异性表达改变，而到了第10 d，则只有20个miRNA差异性表达改变。还有就是miRNA在辐射诱导肿瘤过程中可以发挥促进和抑制作用，高岗［39］利用miRNA芯片筛选α粒子诱发人支气管上皮细胞(BEPZD)恶性转化不同时期差异表达的miRNA，发现与人支气管上皮细胞比较，第20代细胞(RH 20)中存在38个差异表达miRNAs，RH 20和第35代细胞(RHT 35)中变化一致的差异表达miRNAs有25个，RHT35细胞中存在87个差异表达miRNAs;与RH 20细胞相比，RHT 35细胞中存在38个差异表达miRNAs。研究结果提示miRNAs与α粒子诱发细胞恶性转化过程密切相关。

2.2 miRNA与卫生学

卫生学包括职业卫生学、放射卫生学、营养与食品卫生学等。Wang等［40］在一项病例对照研究中，评价了 pre-miRNAs(miR-146a、miR-149、miR-196a2 和miR-499)中 4 个 SNPs(rs2910164、rs2292832、rs11614913和rs3746444)与煤工尘肺危险度之间的关系，发现miR-149 rs2292832 TT基因型与CT/CC基因型相比煤工尘肺危险度明显增加，而且这种危险度的增加在年龄≥68岁、煤尘暴露≥26年和曾经吸烟者之间表现很明显，另外基因型和Ⅱ、Ⅲ期患者之间有明显的关联，表明miR-149 rs2292832的单核苷酸多态性与煤工尘肺发生的易感性有关。

氡(222Rn)普遍存在于环境空气中，是引起人类肺癌的主要因素。高刚［39］选择40例高氡暴露地区居民肺癌组织标本蜡块以及5例对照肺组织标本蜡块，发现高氡暴露地区居民肺癌组织中let7a/c/f、miR-29a/b/c、miR-34a/b/c和miR-200a/b的表达水平显著下调，表明let-7、miR-29、miR-34家族以及 miR-200a/b在氡致肺癌和肺损伤过程中具有重要作用。秦宏冉［41］将我国四川省若尔盖地区一处异常高氡温泉周围97名藏族居民作为高氡组，对照组为49人，发现高氡组(n=22)let-7a和miR-145表达水平下调，而miR-34a和miR-34b表达水平升高，分别是对照组的15.7倍和351.24倍。高氡组miR-34a/b表现出异常高表达，研究提示可能是辐射损伤的早期标记。

Chartoumpekis等［42］用 C57BLJ6 小鼠研究脂肪组织中miRNA在肥胖过程中的意义，发现高脂饮食后共有差异表达miRNA 22个，首次发现在肥胖过程中mmu-miR-342-3p、mmu-miR-142-3p、mmu-miR-142-5p、mmu-miR-21、mmu-miR-146a、mmu-miR-146b 和mmu-miR-379的表达水平上调以及mmu-miR-122、mmu-miR-133b、mmu-miR-1、mmu-miR-30a*、mmumiR-192和mmu-miR-203的表达水平下调，而且基因本体论分析发现，mmu-miR-142-3p、mmu-miR-142-5p等调控的靶基因参与脂肪细胞的分化，高脂饮食可以引起肥胖过程中脂肪组织中miRNA表达的改变，作者推测miRNA在肥胖过程中起调控作用。Romao等［43］研究了miRNA对牛脂肪组织的影响。当赫里福德亚伯丁安格斯牛生长到15.5月龄时收集其皮下脂肪和内脏脂肪，采用miRNA芯片检测发现，在两种脂肪组织中共有207个miRNA表达，其中37个具有组织特异性，而在两种不同饮食中共同表达的miRNAs有169个，其中75个miRNAs具有饮食特异性。进一步RT-qPCR分析证实，受饮食影响的miRNAs有miR-19a、miR-92a、miR-92b、miR-101、miR-103、miR-106、miR-142-5p和miR-296，受脂肪组织影响的有miR-196a和miR-2454，靶基因预测及功能分析显示差异表达miRNA调控的靶基因参与体液新陈代谢和脂肪细胞的分化。研究表明miRNA的表达受到饮食中脂肪的含量和脂肪组织类型的影响，miRNA可能在牛脂肪形成的调控过程中发挥作用。

Jorde等［44］选择10名男性受试者，分为2组，每周给予40.0 IU维生素D3，时间为1年。给药前后经RT-qPCR检测发现第1组血清中有136个miRNAs，并且11个miRNAs表达差异有统计学意义;第2组中发现113个miRNAs，两组中差异表达的miRNAs共有18个。随后又选择37名受试者作为安慰剂对照组，40名受试者服用高剂量的维生素D3，研究发现在给药前检测的血清中25-羟基维生素D与miR-532-3p表达之间有较大的相关性，并且给药前后的对照组以及实验组与对照组之间miR-221的表达差异有统计学意义，表明维生素D可能对血清miRNA的表达谱产生影响。

在人群资料研究中，发现miR-149 rs2292832的单核苷酸多态性与煤工尘肺发生的易感性有关，氡可引起miR-34a/b表达出现异常，可能是辐射损伤的早期标记，高脂饮食可以引起肥胖过程中脂肪组织中miRNA表达的改变，维生素D可能对血清miRNA的表达谱产生影响，因此，miRNA在人群研究中有很重要的意义。

3 展 望

miRNA的发现以及研究的快速发展为预防医学的发展提供了前所未有的机遇。人类对miRNA的研究在预防医学领域已取得一些进展，特别是毒理学中通过检测外源化学物致靶组织miRNA表达谱的变化，有助于早期识别受试物的危险性，对于阐明其毒性机制，提高毒理学安全评估的效能具有很强的指导和现实意义。预防医学是以人群为研究对象，miRNA的人群流行病学调查资料将使人们对环境化学物质暴露与人体健康之间的关系产生新的认识，然而目前国内外对miRNA的研究仍集中于体内和体外实验，人群研究资料相对较少，这是今后miRNA在预防医学领域研究的一个发展方向。现阶段主要的工作仍然是不断发现新的miRNA并弄清其功能和作用机制，相信随着研究的深入，miRNA基因调控的功能和作用机制以及人群研究将在预防医学领域给人类带来更多的福音。

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