弱阳离子磁珠联合MALDI-TOFMS技术检测肾盂尿路上皮癌血清差异蛋白

董德鑫，李汉忠，石冰冰，张玉石，徐维锋

(中国医学科学院北京协和医院泌尿外科，北京100730)

肾盂尿路上皮癌术前诊断困难，需要与肾盂里的凝血块和息肉等进行鉴别，而尿找瘤细胞等确诊阳性率较低［1］。本研究利用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱技术(matrix assisted laser desorption ionization time of flightmass spectrometry，MALDI-TOFMS)比较肾盂尿路上皮癌组和对照组的血清样本，寻找对于肾盂尿路上皮癌具有鉴别意义的血清差异蛋白峰，弥补尿找瘤细胞阳性率不高的缺点，提高肾盂尿路上皮癌的术前诊断率。

1 材料与方法

1.1 研究对象:肾盂尿路上皮癌组:2010年12月至2011年4月期间，于北京协和医院泌尿外科病房采集肾盂癌患者术前血清样本共计16例，其中男性10例，女性6例，年龄范围54～79岁，平均70.3岁。所有患者均行腹腔镜肾盂癌根治术，术后病理确诊为肾盂尿路上皮癌。对照组:采集非肾盂癌对照组术前标本共计11例，均为男性，年龄范围34～77岁，平均52.5岁。术后病理确诊为肾囊肿4例，肾结石4例，良性前列腺增生3例。

1.2 标本收集:清晨空腹状态抽取肘静脉血3～5 mL，置入真空无抗凝剂BD采血管，2 000 r/min，离心10 min后吸取上层血清，分装入艾本德管后置于－80℃低温冰箱冻存。

1.3 实验步骤:200μL样品管加入10μL磁珠结合缓冲液、10μL磁珠和5μL血清吸打混匀，分离后加入100μL磁珠清洗缓冲液，重复上述步骤两次，加入5μL磁珠洗脱缓冲液，分离后将上清液移入新的0.5μL样品管，加入5μL磁珠稳定缓冲液并吸打混匀。

取1μL标准品与10μL基质混合，后取1μL混合液点在Anchorchip靶标准品位置。采用美国AutoflexTMMALDITOF-MS质谱仪，不同结晶点，多点采集，累加5～10个结晶点数据。取磁珠处理后的样品，同标准品点样方法，结果分子量偏差小于100 ppm。

1.4 结果判定:根据整体波形特点，剔除不合格图谱，并对低分子量区间波峰分子量进行校正。采集分子质量区间范围为1～10 ku，选择标准品进行分子质量校正。利用Clin-ProTools2.2软件对质谱图的数据进行分析，筛选血清差异蛋白峰，建立肾盂尿路上皮癌的诊断模型。

2 结果

2.1 肾盂尿路上皮癌与对照组之间血清差异蛋白峰筛选:质谱仪采集分子质量区间1～10 ku范围内全部可识别蛋白峰127个，凝胶模拟示意图(图1)，具有显著差异的蛋白峰6个，分子质量分别为 4074.14、145.15、7475.45、1546.94、2547.55和4592.11(P＜0.05)。

2.2 遗传算法建立肾盂尿路上皮癌诊断模型:利用ClinPro-Tools2.2软件通过遗传算法优化选择，筛选出符合条件的14个差异蛋白峰建立诊断模型(表1)，交叉验证后识别能力为100%。

图1 两组样本血清差异蛋白峰凝胶模拟示意图Fig 1 Gel simulation diagram of differential protein peaks of two samp les of serum

表1 筛选出符合条件的14个差异蛋白峰建立诊断模型Table 1 The diagnosismodel is established by 14 differentially expressed proteins

3 讨论

肾盂尿路上皮癌是发生在肾盂或肾盏上皮的恶性肿瘤，约占所有肾肿瘤的10%左右。本病大多数为尿路上皮癌，尿路上皮癌可在任何被覆有移行上皮的尿路部位先后或同时出现。患者发病年龄多在40岁以上，男女比例约为3∶1，左右发病无明显差异，双侧发病者约2% ～4%［2］。

约70%～90%的肾盂移行细胞癌患者早期临床表现的重要症状为无痛性肉眼血尿，少数病人因肿瘤或凝血块阻塞肾盂输尿管而引起腰部不适、隐痛及胀痛。肾盂癌术前诊断困难，尤其与肾盂里的息肉、血块等良性病变鉴别诊断困难，而尿找瘤细胞等检查阳性率偏低。肾盂占位的术前诊断不同，采取的手术方式截然不同。

MALDI-TOFMS技术是在新近发展起来的蛋白质组学新技术，采集的差异蛋白峰分子质量范围在1～10 Da，结果中许多在统计学上显著差异的蛋白质分子质量在5000 Da以下，MALDI-TOFMS技术在寻找小分子量差异蛋白上的优势明显［3］。遗传算法是近些年发展起来的一种全局优化算法，借用了生物遗传学的观点，通过自然选择、遗传及变异等作用机制，实现个体的适应性提高。本研究利用ClinPro-Tools2.2软件对质谱图的数据进行分析，就是利用遗传算法进行组合优化，筛选多个差异蛋白峰，建立肾盂尿路上皮癌的诊断模型。该诊断模型敏感性和特异性较高。

本研究是应用蛋白组学对肾盂尿路上皮癌的初步研究，应用蛋白组学技术筛选差异蛋白峰，并建立肾盂尿路上皮癌的诊断模型具有较高的敏感性和特异性，可以弥补尿找瘤细胞阳性率不高的缺陷，有利于肾盂尿路上皮癌的早期诊治。

［1］Giebel R，Worden C，Rust SM，et al．Microbial fingerprinting using matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flightmass spectrometry(MALDI-TOF MS)applications and challenges［J］．Adv Appl Microbiol，2010，71:149－184．

［2］Raman JD，Scherr DS．Management of patients with upper urinary tract transitional cell carcinoma［J］．Nat Clin Pract Urol，2007，4:432 －443．

［3］Wong MY，Yu KO，Poon TC，etal．Amagnetic bead-based serum proteomic fingerprintingmethod for parallel analytical analysis andmicropreparative purification［J］．Electrophoresis，2010，31:1721－1730．