钙网蛋白与肿瘤治疗

高树峰，徐 莲 ，张少容，李 黎 ，汪美群，刘月辉

(南昌大学第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科，江西南昌330006)

钙网蛋白(calreticulin，CRT)为主要存在于内质网(endoplasmic reticulum，ER)且高度保守的一种Ca2+结合蛋白，包括协助蛋白质加工折叠、调节细胞内钙平衡、抑制肿瘤血管新生和参与抗原递呈及细胞凋亡等功能。最近发现，CRT在临床肿瘤的治疗方面有着不可估计的应用前景，成为研究热点之一。

1 CRT的生物学特性

1.1 CRT结构

CRT为生物体内高度保守、长约3.6 kb，分子质量46.5 ku、由单基因编码的可溶性Ca2+绑定伴侣蛋白，属热休克蛋白(heat shock protein，HSP)。人CRT基因位于第19号染色体p13.3～p13.2区段，由8个内含子和9个外显子组成，分别包含于疏水的17肽信号顺序和3个功能不同的结构端:高度保守近似球形结构的N端、参与ER内Ca2+储存呈酸性的C端和中间富含脯氨酸成“延长的臂膀”式结构的 P 端［1］。

1.2 CRT分布及功能

CRT在多种肿瘤发现表达，如白血病、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌和肝癌等［2－3］。CRT主要存在于ER，还存在于胞膜、胞质或胞外基质等所谓的非ER-CRT，非ER-CRT可能成为自身抗原，导致自身免疫性疾病的发病源［4］。最初认为CRT主要调节Ca2+平衡，但随着研究的深入，发现其参与新生蛋白的加工、低聚糖的降解、抗原提呈且在细胞凋亡和抑制血管生成中也发挥重要作用［5］。其次，在绑定Ca2+调节胞内钙、增加 ER-Ca2+的蓄存、调整ER-Ca2+-ATP酶功能、控制细胞黏连和类固醇敏感性基因表达起重要作用［6］。再次，CRT还参与“ER质量监控”，阻止不正确折叠表达和未完整合成人类组织相容性抗原-I(HLA-I)的分泌及聚集，CRT稳定完整的表达可促进某些肿瘤的免疫原性凋亡［4，7］。此外，CRT 还在抑制体内补体经典途径的激活、参与生殖细胞和心血管系统的早期发育方面起到密切作用［8］。

1.3 CRT调节机制

CRT可增加胞内Ca2+通过ER的流动，同时降低线粒体Ca2+的浓度并降低膜电位，因此，Ca2+在ER和线粒体间的周转增加可能会损坏线粒体，此可使肿瘤细胞对凋亡信号刺激的感受性增强。另外CRT过表达的肿瘤对放、化疗诱发的细胞凋亡更敏感，还可通过改变Ca2+稳态、阻止Akt信号传导来调节P53功能，以调整其诱发细胞凋亡。此外，凋亡细胞表面的CRT还能被树突状细胞(dendritic cells，DCs)识别，促进凋亡细胞被清除，参与抗原提呈和活化特异性免疫应答［4］。近年来研究表明CRT从ER移位到胞膜是凋亡细胞免疫原性的重要标志，决定特异性抗肿瘤免疫应答的产生［9～13］。蒽环类药物亦能快速诱导HSP90和HSP70的膜外翻以及HMGB-1的释放，通过TLR4受体HMGB-I可促进凋亡细胞向DCs提呈，经药物处理的肿瘤细胞能激活DCs并增强吞噬，而此后的DCs可激活释放γ-IFN的特异性CD4+、CD8+CTL，并诱导特异性免疫应答的产生［14－15］。

1.4 CRT与凋亡细胞的清除

凋亡细胞的清除是维持机体内环境稳定的基本生理过程，主要靠吞噬细胞的有效识别和吞噬。而CRT、HMGB-l、HSP等特征性的蛋白分子可激发体内免疫细胞对凋亡细胞的有效识别与攻击，所以作为特异性识别信号的CRT对凋亡细胞的有效识别及清除起关键作用，是吞噬过程中的重要膜配体分子。细胞发生凋亡时，CRT会发生簇集，成为被吞噬细胞表面的清道夫受体LDL相关蛋白所能识别的与Ps、C1q形成的“来吃我”信号识别复合体，从而启动清除、吞噬的过程［4，16］。结肠癌细胞CT26用蒽环类药物处理后:胞膜表面CRT呈高表达并团状聚集，而特征性的凋亡细胞表现PS外翻在用药数小时后才会出现。同时，可快速诱导CRT膜转位，促使凋亡细胞被DCs等识别并呈递给CD4+和CD8+CTL，从而激发抗肿瘤免疫应答［9］。

1.5 CRT与肿瘤免疫原性

CRT的表达可促进肿瘤细胞免疫原性死亡，利于残瘤清除，这为抗肿瘤治疗提供了一种有效的免疫靶点。研究发现在凋亡早期胞膜表面的CRT改变可引起有效识别、攻击肿瘤的免疫原效应［5］。而增强CRT表达的蛋白磷酸酶GADD34抑制剂或重组CRT与丝裂霉素C和依托泊苷等联合使用，可把非免疫原性的肿瘤细胞死亡转化诱导为免疫原性死亡［9］。虽然不同的化疗药物能通过相同的细胞凋亡方式来杀死肿瘤，但激活免疫力的能力却不尽相同，ER-CRT移位到胞膜表面是DCs识别和吞噬坏死肿瘤细胞的关键过程，葸环类药物和γ射线可诱导CRT移位，因此，消除CRT的存在也消除了葸环类药物诱导的免疫原性，即诱导CRT移位的药物或外源性CRT均可加强凋亡细胞的免疫原性［17］。另CRT本身具有较强的免疫佐剂功能，胞膜上的多糖分子能与CRT相互结合，此可促进B细胞活化与成熟，致相应抗体的产生［18］。

2 CRT的临床应用研究

2.1 CRT与机体致瘤

在肿瘤转化形成中多种抗原同时也会产生，为阻止肿瘤形成，机体免疫系统通过启动针对新抗原的免疫应答杀伤肿瘤细胞。研究指出:由CD8+CTL介导的细胞免疫在机体肿瘤排斥方面起重要作用，但肿瘤抗原并不能被CTL完整识别，抗原肽MHC-I分子复合体才被有效识别，而在ER中肿瘤抗原被降解加工成短肽并与装载到MHC-I分子复合体的肽结合后一起被转运至细胞表面供CTL识别。细胞系(K42)CRT-其抗原肽正确装载下降50% ～80%，并影响CTL对2/3抗原肽的有效识别，而转染CRT基因后则能恢复上述功能的正常化［19］。CRT N端序列能抑制血管生成、内皮增生和肿瘤形成。除此，把从AML和膀胱癌患者中提取的CRT+肿瘤细胞种植于裸鼠与种植CRT－形成的肿瘤对比，显示CRT+组有功能性活力和致瘤潜能［2］。

2.2 CRT与肿瘤的诊断及预后

不能早期诊断而错过最佳治疗时机是肿瘤患者死亡率高的一个重要原因，追其根源就是早期缺乏敏感性强、特异性高的肿瘤标记物，所以寻找利于肿瘤早期诊断的标记物至为关键，而多种瘤中CRT及其裂解片段较正常组织有明显量的改变，提示其可能成为合适的新肿瘤标记物。膀胱癌的研究中通过检测尿中CRT发现其表达量也明显增加，考虑是否将CRT作为潜在生物学标记应用于早期诊断［3］。另外，在神经母细胞瘤和结肠癌中CRT的高表达直接关系到肿瘤的进展，尤其表现在高度恶性和低分化区域，表明CRT与肿瘤的生长、分化、转移和预后有直接关系［20］。

2.3 CRT与肿瘤的基因治疗

CRT与肿瘤的演化密切关联，与肿瘤特异性抗原形成的CRT识别复合体被DCs识别和吞噬能提高MHC-I类分子的折叠处理及抗原提呈能力，诱导机体产生、活化特异性CD8+CTL并形成适应性抗肿瘤免疫应答。牛痘疫苗是特异性抗原免疫治疗的重要载体，将CRT与HPV16型E7、牛痘疫苗相连组成Vac-CRT-E7融合疫苗对小鼠进行腹腔注射，示融合疫苗组产生的特异CD8+CTL较单独使用肿瘤特异性抗原肽或CRT免疫产生的效果更明显，实验组 E7特异IL-2及TNF-γ干扰素分泌性 CD8+CTL激活比例增多，并对表达E7的肿瘤产生显著抗瘤效应，提示此融合疫苗可作为肿瘤基因治疗研发的新策略［21－22］。将CRT与胞膜上的G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)基因重组，再转染至鼠黑素瘤细胞表达出CRT-GPCRs融合蛋白，观察到实验鼠体内诱导出很强的抗同种瘤的抗原呈递杀伤效应，提示此重组细胞具备用于高级哺乳动物肿瘤疫苗的潜在实用价值［10］。另用CRT-E7融合基因的腺病毒携带载体和含E7-CRT的基因疫苗免疫小鼠，荷瘤小鼠不但产生了明显的抗瘤效应，且诱导并强化了免疫记忆细胞，为肿瘤治疗性疫苗的研究迈出了关键一步［21］。

2.4 CRT与肿瘤的放疗

神经胶质瘤H4细胞中的CRT表达高于成胶质细胞瘤(U25lMG和T98G)，其对γ射线的敏感性显示前者远高于后者;同时，将CRT基因导入低表达CRT的U251MG并检测CRT过表达，同样放射当量下，导入CRT基因组辐射诱导的凋亡明显高于未转染组，并导致Ca2+依赖性的Akt脱磷酸与失活的蛋白磷酸酶2Aca表达的上调，Akt途径的细胞存活信号在此过程中受到明显抑制，最终增强放射诱导胶质瘤细胞凋亡的作用，证实了CRT可提高胶质瘤细胞对放射的敏感性，这为易产生耐受且对放疗敏感的恶性肿瘤治疗提供了另一条路径。但基础研究中其他肿瘤放疗敏感耐受性实验探究尚有待陆续展开［22］。

3 小结与展望

综上所述，CRT在肿瘤综合诊治方面有着广阔的应用前景:在肿瘤胞膜的表达能促进其免疫原性凋亡，利于残瘤清除，通过与自身抗原复合物结合抑制补体激活和协助抗体入胞等，为疾病提供了有效的免疫治疗靶点;近年证实CRT还可增强肿瘤对化疗的敏感性，为肿瘤的基因治疗和放疗提供了新策略;因多种肿瘤CRT表达较正常细胞有明显改变，与肿瘤的发生、发展及预后密切关连，有望在肿瘤早期诊断及预后判断方面发挥作用。但是，CRT单独或联合其他基因的综合治疗性实验研究还有待进一步证实;另外，CRT的实验研究成果要真正应用临床还有待可行性临床试验证实，此已成为领域内研究热点，有望成为临床肿瘤综合治疗中的一道新曙光。

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