离子液体双水相提取菜籽粕蛋白及其相行为的研究

陈梅梅 袁 磊 高 梅 刘晓庚施荣华 朱 洵 解海龙 苗红莹

（南京财经大学图书馆室1，南京 210046）

（南京财经大学食品科学与工程学院2，南京 210046）

（江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室3，南京 210046）

离子液体是在室温或接近室温下以液体状态存在的有机熔融盐，它完全由离子组成［1］，其具有不易挥发、稳定性高、溶解能力强、功能可调节等优点，应用领域从开始的化学合成发展到今天的材料科学、环境科学、分析测试、生物催化等领域［2－4］。

已有不少文献报道了离子液体可形成双水相体系，且该体系在萃取分离领域表现出优异的性能［5］。Jiang等［6］利用离子液体双水相分离了青霉素；Ana等［7］用离子液体双水相提取分离了香兰素；豆甲立等［8］研究了阳离子表面活性剂／离子液体／水三元体系20℃时的相图，并用其成功提取分离了辣椒色素；邱祖民等［9］研究了PMBP缩2－ABT与中性磷类提取剂磷酸三丁酯（TBP）在离子液体双水相体系中对稀土离子的萃取行为。对于该体系在蛋白质提取分离方面的应用与作用机制，在初步研究基础上［10］，本试验探讨了亲水性离子液体［Bmim］Cl和K2HPO4形成上相富集离子液体和下相富集磷酸盐的双水相体系的成相规律，并对菜籽粕中蛋白质进行了提取研究。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

菜籽蛋白（由低温菜籽粕用酶法提取制得［11］，经Kjeldahl法测得蛋白质量分数76.5%）：自制品；1－丁基－3－甲基咪唑氯盐（［Bmim］Cl）、1－烯丙基－3－甲基咪唑氯盐（［Amim］Cl）、1－乙基吡啶溴盐（［Epy］Br）（纯度均 ＞99%）：中科院兰州物理化学研究所；Commassie Blue Staining G－250溶液、Britton－Robinson（B.R）缓冲溶液：均按常规方法配制；K2HPO4等化学试剂均为分析纯：水：自制纯水。

722型可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；pHs－3C型精密酸度计：上海雷磁仪器厂；THZD台式恒温振荡器：太仓市强乐实验设备有限公司；SL1202型电子天平：上海民桥精密科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 相图的绘制［12］

溶解度测定：在30℃恒温下，首先称取一定量的K2HPO4（m1）于烧杯中，加蒸馏水溶解，然后加入一定量的离子液体（m2），直至混合溶液恰好出现浑浊，称量（m总），即可得到各组分的质量分数，再加蒸馏水至澄清，如此循环数次后得到溶解度曲线，用经验方程关联K2HPO4质量分数与离子液体质量分数的关系，并绘制相图。

相平衡数据测定：以三角形相图为指导，选取大致合适当系统点配制溶液。于15 mL刻度试管中，加入一定量的离子液体，再加入一定量K2HPO4水溶液，定容至刻度，振荡摇匀60 min，放置2 h，待溶液分相完全，分别测得上、下相溶液的密度及K2HPO4的质量（用磷钼蓝分光光度法［13］测得），得到上、下相中K2HPO4的质量分数；利用溶解度曲线的经验关联方程由K2HPO4质量分数算得离子液体的质量分数，从而得到上、下相中各组分的质量分数，即为双水相液－液相平衡数据。

1.2.2 离子液体双水相提取菜籽蛋白

在10 mL刻度比色管中加入3.000 g的离子液体，0.800 g的K2HPO4，一定量的菜籽蛋白溶液，在研究酸度影响时再加入不同pH值的B.R缓冲溶液1.00 mL，用二次水稀释到8.00 mL。200 r／min恒温震荡20 min，放置30 min，分相清晰后，取上相溶液用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量，按下式计算菜籽蛋白的提取率（E）及分配比（D，为避免相比（上下两相液体的体积比）的影响而选定分配比为两相蛋白质质量比）。上相离子液体可通过旋转蒸发和真空干燥过夜等简单处理后重复使用。

蛋白质提取率＝（上相蛋白质质量／加入的总蛋白量）×100%

分配比＝上相蛋白质总质量／下相蛋白质总质量

1.2.3 数据处理与分析方法

相图采用Origin8.0软件绘制并用经验法进行分析；其他数据用Excel 2003软件处理并用直观分析法和方差分析法进行分析。

2 结果与讨论

2.1 ［Bmim］Cl／K2 HPO4双水相系统相图

2.1.1 溶解度曲线及相图

按1.2.1方法测得30℃时［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O体系的数据用1.2.3方法绘得相图如图1所示。在此三角相图中，溶解度曲线的两个端点A和B表示［Bmim］Cl＋K2HPO4＋水的饱和溶液，A点为［Bmim］Cl饱和水溶液，B点K2HPO4饱和水溶液，而点 M和点 N则分别表示［Bmim］Cl和K2HPO4水的饱和溶解度。连接 PQ，PM，QN，AP，AQ将相图分为五个区域：其中Ⅰ区域为K2HPO4＋［Bmim］Cl＋H2O不饱和溶液的单相区；Ⅱ区域为双水相区上相为离子液体相，主要含有大量的［Bmim］Cl及少量的K2HPO4和水，而下相为水相，主要为大量的水和K2HPO4及少量的［Bmim］Cl；Ⅲ区域为［Bmim］Cl＋K2HPO4＋两个水饱和溶液（P和Q）与［Bmim］Cl固体（A）的三相区；Ⅳ区域为［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O的饱和溶液（Q）、K2HPO4的饱和水溶液（N）与［Bmim］Cl固体（A）的三相区；Ⅴ为［Bmim］Cl饱和水溶液（M）、［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O饱和溶液与［Bmim］Cl固体（A）的三相区。试验结果可知，［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O系形成双水相，质量分数范围：［Bmim］Cl为5.16%～63.74%，K2HPO4为4.48%～76.72%，H2O为18.12%～60.88%。

图1 30℃［Bmim］Cl＋K2 HPO4＋H2 O三元体系相图

2.1.2 温度对相图的影响

按1.2.1方法测得不同温度下［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O三元体系相图，如图2所示。由图2可知，随温度从30℃升高到60℃，溶解度曲线向内收缩，上相的离子液体相所占比例逐渐下降，这表明高温使双水相区的离子液体相体积缩小，相比明显降低，对双水相的稳定性和蛋白质的提取不利。为使离子液体双水相对菜籽粕蛋白的稳定且良好的提取效果，故本试验的离子液体双水相体系提取分离菜籽蛋白时温度选用30℃。

图2 不同温度［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O三元体系相图的影响

2.1.3 溶解度曲线的关联

按1.2.1的浊度法测得30℃时［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O体系中上、下相［Bmim］Cl、K2HPO4溶解情况，结果如图3和图4所示；又用Origin8.0软件对其进行非线性回归，结果得到上、下相的K2HPO4与［Bmim］Cl质量分数的方程为式（1）、（2）。从相关系数看，在该体系的上、下相中K2HPO4与［Bmim］Cl质量分数有极高的关联精度，也说明两方程式的表述是可靠的。

图3 上相K2HPO4与［Bmim］Cl质量分数的关系

图4 下相K2HPO4与［Bmim］Cl质量分数的关系

2.2 离子液体双水相提取菜籽蛋白

2.2.1 离子液体对体系成相及菜籽蛋白提取率的影响

分别用［Amim］Cl、［Bmim］Cl和［Epy］Br等离子液体与K2HPO4形成双水相体系提取菜籽蛋白，其中［Bmim］Cl的提取率最高（≥98%），且用量少，成相明显，故试验中选用［Bmim］Cl作为成相的离子液体。

在只改变［Bmim］Cl加入量下按试验方法试验，考察［Bmim］Cl加入量对菜籽蛋白提取率的影响。从图5表明，当离子液体质量浓度＜250mg／mL时，溶液不成相；当离子液体质量浓度≥250mg／mL时，随着离子液体浓度的增大，相比逐渐增大，菜籽蛋白的分配系数也增大，其提取率也同时增大。当离子液体质量浓度低于350mg／mL时，随着离子液体质量浓度的增大，提取率逐渐增大；当在350～400 mg／mL之间时趋于一定，提取率也达到最大（＞98%）；当大于400mg／mL时，离子液体浓度过高，体积排阻效应增大导致菜籽蛋白在相间的传递和在相中的扩散阻力大大增加，不利于蛋白质进入离子液体相，提取率明显降低。综合考虑，试验中离子液质量浓度选为350mg／mL。

图5 ［Bmim］Cl质量浓度对提取率和分配比的影响

2.2.2 盐对体系成相及菜籽蛋白提取率的影响

按1.2.2方法，进行盐的单因素考察试验，结果如图6。从图6可知，当K2HPO4质量浓度＜100mg／L时，溶液不成相；当K2HPO4质量浓度≥100mg／L时，形成双水相，且随着盐量的增加，相比逐渐减小。蛋白质提取率在体系不形成双水相前几乎不变化，形成双水相后迅速达到最高峰，然后随盐量的增加由于相比和分配比都呈逐渐减小趋势，而使提取率呈现逐渐下降，且下降速率几乎恒定。其原因是：盐量太少体系不成相或提取不完全，当K2HPO4质量浓度达150mg／L时提取率最大（≥99%），盐的质量浓度超过150 mg／L后提取率又有所减小；这可能是盐的浓度过大，对蛋白质产生的盐效应起主要作用，影响了离子液与菜籽蛋白作用的稳定性，从而降低蛋白质的提取率。

图6 K2 HPO4浓度对提取率和分配比的影响

2.2.3 蛋白质浓度对体系成相和提取率的影响

按1.2.2方法，进行蛋白质浓度的单因素考察试验，结果如图7。从图7可知，当菜籽蛋白质量浓度低于75.0 mg／L时，蛋白质的提取率随蛋白质浓度增大而增大；当菜籽蛋白质量浓度在65.0～110 mg／L之间时，提取率变化趋于基本平稳，但稍有下降；当菜籽蛋白浓度大于110 mg／L，提取率呈明显下降趋势。

图7 菜籽蛋白浓度对提取率和分配比的影响

2.2.4 pH值对体系成相和菜籽蛋白提取率的影响

按1.2.2方法，进行不同pH值的B.R缓冲溶液的单因素考察试验，结果如图8。从图8可知，溶液pH值在4～7时菜籽蛋白提取效果好。pH值＞7或pH值＜4，菜籽蛋白提取率均呈下降趋势，且酸性条件下的下降趋势显著大于碱性。其原因是：蛋白质与离子液体之间的作用力主要为静电作用和氢键作用［10］，菜籽蛋白等电点为3.5，在等电点及附近离子液体与蛋白质间主要靠氢键作用，随着pH值减小，蛋白质带正电荷越明显，与离子液体阳离子间排斥作用增强，从而使提取率降低；当溶液pH值在大于等电点的一定范围内时，带负电荷蛋白质增强了与离子液体中阳离子间静电引力，从而提取率较高。

图8 溶液pH对提取率和分配比的影响

2.2.5 离子液体双水相提取菜籽蛋白质条件的优化

根据上述单因素试验结果，在［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O双水相体系中，选择［Bmim］Cl浓度、K2HPO4浓度、菜籽蛋白质浓度和pH值等4个因素，依据优化理论［14－15］设计 L16（45）正交试验来优化并确定其最佳工艺条件，其试验设计与安排见表1、试验结果与分析见表2。

由表2可以看出，经极差分析得到所考察的4个因素对菜籽粕蛋白质提取影响顺序为：K2HPO4浓度＞［Bmim］Cl浓度＞菜籽蛋白浓度＞提取pH值。可见在此提取体系中盐（K2HPO4）浓度对其提取蛋白质的影响最大，而提取体系的pH值影响最小。方差分析结果也表明该提取体系中的盐（K2HPO4）浓度属极显著的影响因素，离子液体（［Bmim］Cl）和蛋白质浓度属于显著的影响因素，pH值为不显著的影响因素。正交试验优化得到的该离子液体双水相提取菜籽蛋白的最优条件为：K2HPO4质量浓度为150 mg／mL、［Bmim］Cl质量浓度为 350 mg／mL、菜籽蛋白浓度为70.0 mg／L、pH值为6.8。根据正交试验效应指标的估算方法［15］得在最佳条件下的蛋白质优提取率 Y优＝Y平均＋w1，max＋w2，max＋w3，max＝85.6＋8.63＋7.10＋4.28＝105.6%，出现估算提取率＞100%的原因是试验过程存在一定的误差和估算的方法有一定的局限性。进一步的验证试验结果表明，在此最佳条件下菜籽蛋白提取率为99.1%，这与按优化理论［15］的估算值（105.6%）虽有6.5%的差值，但还是在试验允许的误差范围内，因此认为两者的结果还是基本吻合，也反映所设计的优化试验是科学的，试验结果是可靠的。

表1 L16（45）正交试验的安排

表2 L16（45）正交试验的结果及分析（n＝3）

3 结论

3.1 采用浊度法测定得到［Bmim］Cl和K2HPO4在纯水中的溶解度曲线，用回归法得到溶解度方程具有高度的关联性（相关系数均＞0.99），通过绘制的30℃下［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O三元体系的相图表明：该体系相图分为5个相区：1个不饱和溶液单相区，1个双水相区，3个三相区；这为利用双水相体系提取分离蛋白质提供了理论和试验基础。

3.2 试验得到30℃时［Bmim］Cl／K2HPO4体系形成双水相的质量分数范围为：［Bmim］Cl为5.16%～63.74%，K2HPO4为 4.48%～76.72%，H2O为18.12%～60.88%。这些相行为的信息为进一步开发［Bmim］Cl／K2HPO4双水相体系对生物活性物质的提取分离提供了指导。

3.3 通过L16（45）正交试验优化得到［Bmim］Cl／K2HPO4离子液体双水相体系提取菜籽粕中蛋白的最佳提取条件为：K2HPO4质量浓度为 150 mg／mL、［Bmim］Cl质量浓度为350 mg／mL、菜籽蛋白质量浓度为70.0 mg／L、pH值为6.8；且验证试验的结果菜籽蛋白提取率达99.1%，与按优化理论的估算值基本吻合。表明优化试验是成功可靠的，为今后进一步研究该体系的放大试验或规模化生产奠定了相应的试验基础。

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