米糠多糖和大豆多糖的结构特征及免疫调节活性比较

易 阳 张名位 魏振承 黄 菲

（广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所1，广州 510610）

（武汉工业学院食品科学与工程学院2，武汉 430023）

稻谷和大豆是极其重要的粮油资源。2010年，我国稻谷产量接近2亿吨，而以大豆为主的豆类产量也有近0.2亿吨［1］。米糠和豆粕分别是稻谷和大豆加工的主要副产物，目前绝大部分作为动物饲料原料被廉价消耗掉。为提高米糠和豆粕的经济附加值，其功能活性成分，特别是多糖的生物活性评价及开发利用受到广泛关注。多糖能有效调节机体免疫功能，且不会产生（显著的）毒副作用。香菇多糖、云芝多糖和裂褶菌多糖等，作为理想的免疫佐剂在临床应用上表现突出［2］。而灌胃一定剂量的米糠多糖或大豆多糖均能明显提升正常小鼠免疫系统功能，对淋巴细胞增殖和巨噬细胞吞噬功能有显著的增强作用［3－5］。但其能否直接刺激细胞免疫应答，以及是否作用于相同的效应细胞，尚鲜见报道。多糖主要通过细胞表面受体与淋巴细胞和巨噬细胞结合，进而触发一系列的免疫应答反应，其构效关系的本质在于多糖结构与受体亲和力的强弱［6－7］。多糖的结构复杂且多样，不同结构对免疫细胞受体的亲和力不同导致其活性有所差异，而关于米糠多糖和大豆多糖的免疫调节活性强弱尚未可知。鉴于此，本研究采用热水法从米糠和豆粕中提取分离粗多糖，分析比较其结构特性及体外对淋巴细胞和巨噬细胞的免疫刺激作用。

1 材料与方法

1.1 材料及试验动物和细胞

脱脂米糠、豆粕：广东省农业科学院农业生物技术研究所粮油加工与功能食品实验室；RAW264.7细胞：中山大学实验动物中心，由本实验室继代培养；体重（20±2）g的BALB／C雄性小鼠：南方医科大学实验动物中心，在9～10周龄时进行试验。

1.2 试剂及仪器

RPMI1640培养基、DMEM培养基和胎牛血清：美国Gibco公司；甲基噻唑基四唑（MTT）、刀豆球蛋白A（ConA）和脂多糖（LPS）：美国 Sigma公司；考马斯亮蓝试剂盒：南京建成生物工程研究所。

SBS－Z100数控计滴自动部分收集器、L－2恒流泵：上海青浦泸西仪器厂；Nexus 5DXC红外分光光谱仪、MK3酶标仪：美国赛默飞世尔公司；MCO－175水套式 CO2培养箱：日本三洋公司；Agilent 6890－5973气质联用仪：美国安捷伦科技有限公司；L－8900氨基酸自动分析仪：日本日立公司。

1.3 米糠多糖和大豆多糖的制备

米糠多糖和大豆多糖的提取方法参考文献［8］，略有修改。50 g原料加入500 mL蒸馏水，在80℃水浴下恒温搅拌浸提4 h。4 500 r／min离心10 min分离上清液（米糠上清液需采用酶法除去可溶性淀粉），过滤分离提取液。采用Sevag法去除蛋白后，真空旋转蒸发浓缩提取液。将浓缩液转入透析袋（分子截留量8 000）中，在大量4℃蒸馏水中透析72 h。4 500 r／min离心10 min分离透析清液，浓缩并冷冻干燥为多糖样品。米糠多糖（RBP）和大豆多糖（SBP）的得率分别为1.24%和1.09%。

1.4 化学组成测定

多糖含量采用苯酚硫酸法［9］测定；蛋白质含量采用考马斯亮蓝试剂盒测定；单糖组成参考文献［10］采用GC－MS测定；氨基酸组成参考文献［11］采用氨基酸自动分析仪测定。

1.5 相对分子质量分布分析

相对分子质量分布参考文献［12］采用Sephadex G－100凝胶过滤法测定。

1.6 光谱特征扫描

多糖的红外和紫外光谱特征参考文献［10］测定。

1.7 脾淋巴细胞增殖测定

小鼠经摘眼球放血处死后，按实验室常规制备单个脾细胞悬液。以含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为1×107cells／mL，50 μL／孔加入96孔板中。多糖经完全培养液溶解并过滤除菌后，以40μL／孔 加入细胞孔内，随后每孔加入10μL培养液、50μg／mL ConA或50μg／mL LPS（多糖终浓度分别为0、50、100、200或 400μg／mL）。各试验组均设6个复孔，另设100μL培养液孔用于调零。将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养68 h，每孔加入5 mg／mL的 MTT 20μL。继续培养4 h后，每孔加入100μL酸性异丙醇，放置过夜。于570 nm下用酶标仪测各孔吸光值（A）。淋巴细胞增殖刺激指数 SI＝（A刺激组－A空白组）／A空白组×100%。

1.8 巨噬细胞吞噬功能和NO生成测定

RAW264.7巨噬细胞经DMEM完全培养液调整细胞浓度为5×105cells／mL，以100μL／孔 加入96孔板中，于培养箱中孵育3 h后，经磷酸盐缓冲液（PBS）洗去未贴壁细胞。多糖由完全培养液溶解并过滤除菌后，以100μL／孔 加入96孔板，终浓度为0、50、100、200或 400μg／mL，各浓度均设6个复孔。另设5μg／mL LPS刺激孔作为阳性对照。细胞培养24 h后，吸除上清液，以 PBS洗涤2遍，每孔加入0.1%中性红的PBS溶液100μL，并继续培养4 h。再弃去上清液，并用PBS洗涤3遍，每孔加入细胞裂解液100μL，4℃下放置过夜。于570 nm下用酶标仪测各孔A值。吞噬指数 PI＝（A刺激组－A空白组）／A空白组×100%。

5×105cells／mL的RAW264.7巨噬细胞以500 μL／孔加入24孔板中，于培养箱中孵育3 h后，由PBS洗去未贴壁细胞。多糖以500μL／孔加入24孔板，终浓度为0、50、100、200或400μg／mL，各浓度均设6个复孔。另设5μg／mL LPS刺激孔作为对照。细胞培养24 h后，每孔分别取150μL细胞液于1.5 mL离心管中，加入300 g／L的 ZnSO4溶液 10μL，混匀沉淀蛋白。每孔平行取样3次。4 500 r／min离心10 min后，取100μL上清液于96孔培养板中，加入等体积的Griess试剂，室温下轻轻摇振10 min，并于酶标仪上测定492 nm处A值。通过NaNO2建立的标准曲线计算细胞液中 NO浓度（c，μmol／mL）。NO生成指数 NI＝（c刺激组－c空白组）／c空白组×100%。

1.9 统计分析

采用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析，并以S－N－K检验比较各组间差异，显著性水平为P＜0.05，以不同小写字母标示。数据以¯±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 RBP和SBP的化学组成

由表1可见，RBP和SBP的多糖及蛋白含量存在极为明显的差异，其多糖与蛋白的质量比值分别为7.71和1.90。多糖部分，RBP主要由葡萄糖和甘露糖以物质的量比4.27∶1.00组成，而SBP主要由葡萄糖、半乳糖和甘露糖以物质的量比5.55∶3.49∶1.00组成。蛋白质部分，RBP中检测出17种氨基酸，而SBP中含有15种且未检测出天冬氨酸和丝氨酸，两者的氨基酸组成中均以谷氨酸含量最高（表1）。

表1 多糖RBP和SBP的化学组成

2.2 RBP和SBP的相对分子质量分布

多糖分子通过凝胶柱时，各级分根据相对分子质量大小实现分离。由图1可见，RBP的相对分子质量分布较SBP分散。RBP在洗脱体积10～35 mL内出现4个叠加的多糖峰，且以相对分子质量较低级分（峰值31 mL）的含量最高。同时，该级分的多糖峰与蛋白峰响应一致，推断为蛋白多糖。SBP仅呈现唯一的多糖峰，且同在峰值30 mL处出现蛋白峰，说明含有少量结合蛋白。由此可见，RBP和SBP的主要组成级分为蛋白多糖。

图1 多糖RBP和SBP的Sephadex G－100凝胶过滤色谱图

2.3 RBP和SBP的光谱特征

由紫外光谱图可见（图2），RBP和SBP分别在262和258 nm处出现明显的蛋白吸收峰。红外光谱分析发现RBP和SBP都具有多糖和蛋白的特征吸收（图3），包括：3 398.2和 3 402.6 cm－1处羟基 O—H的伸缩振动吸收峰；2 930.8和2 933.4 cm－1处氨基C—H的伸缩振动吸收峰；1 654.9和1 654.1 cm－1处羰基C═O的伸缩振动吸收峰；1 541.5和1 558.5 cm－1处氨基N—H的弯曲振动吸收峰；1 419.9和1 405.9 cm－1处羧基C—O的伸缩振动吸收峰；以及1 024.3和1 050.9 cm－1处羟基O—H的弯曲振动吸收峰。930.1和925.8cm－1处的反对称环振动吸收峰说明RBP和SBP均含有D吡喃葡萄糖，而849.9和831.5 cm－1处吸收峰说明其均含有α型糖苷键。

图2 多糖RBP和SBP的紫外光谱图

图3 多糖RBP和SBP的红外光谱图

2.4 RBP和SBP对脾淋巴细胞增殖的影响

由图4可见，RBP和SBP在50μg／mL剂量下促进正常淋巴细胞增殖，但随剂量增加表现出明显的抑制作用。相比 ConA对照组，二者在50～400 μg／mL剂量范围内均显著刺激ConA诱导的淋巴细胞增殖（P＜0.05），且以400μg／mL剂量的 SI值较高。相同剂量下，RBP和SBP对正常或ConA诱导的脾淋巴细胞增殖的SI值无显著差异（P＞0.05）。相比LPS对照组，50μg／mL的RBP和SBP均能显著刺激LPS诱导的细胞增殖（P＜0.05），且两者无显著差异（P＞0.05），而其高剂量都未表现出刺激作用。相反，200和400μg／mL的 SBP显著抑制 LPS诱导的增殖作用（P＜0.05）。

图4 多糖RBP和SBP对脾淋巴细胞增殖的影响

2.5 RBP和SBP对巨噬细胞吞噬功能及NO生成的影响

由图5可见，RBP和 SBP在50～400μg／mL剂量范围内均能不同程度增强巨噬细胞的吞噬功能，且PI值与5μg／mL剂量LPS的作用相当或更高。RBP和SBP在200μg／mL剂量下的PI值均显著高于其他剂量（P＜0.05）。在100～400μg／mL范围的相同剂量下，RBP的PI值明显高于SBP（P＜0.05）。

图5 多糖RBP和SBP对巨噬细胞吞噬功能的影响

图6 多糖RBP和SBP对巨噬细胞NO生产的影响

由图6可见，RBP在50～400μg／mL的剂量范围明显抑制巨噬细胞NO生成，而SBP却能不同程度刺激巨噬细胞NO生成。但SBP作用下的NI值随剂量的增加显著降低（P＜0.05），其中仅50μg／mL剂量的刺激效果显著强于5μg／mL剂量 LPS（P＜0.05）。

3 讨论

分析60%乙醇沉淀的米糠粗多糖的组成发现，其中相对分子质量较小级分的蛋白质含量最高，而相对分子质量较高级分的含量（48.1%）最高，且其主要亚级分由阿拉伯糖、半乳糖、木糖和葡萄糖组成［13］。通过热提－极性pH值法提取得到的大豆粗多糖主要由含有9.2%结合蛋白的级分SSPS－1和蛋白质量分数86.7%的糖蛋白SSPS－2组成（与图1中凝胶色谱分析较一致），而SSPS－1主要由鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖组成［14］。本研究分离得到的RBP和SBP的蛋白质含量、单糖组成以及相对分子质量分布均与已有文献存在较大差异，可能源于原料品种、提取方法以及纯化程度的不同。β－消去反应过程中，丝氨酸和苏氨酸与单糖形成的O型糖苷键在弱碱条件下生成α－氨基丙烯酸和α－氨基丁酸，并导致240 nm处吸收增加［15］，由此证实RBP和SBP中均存在O型糖苷键（图2）。结合化学组成和光谱分析，可以推断RBP和SBP为主要由α－D－葡萄糖组成的蛋白多糖。

ConA和LPS诱导的淋巴细胞增殖体系常分别用于评价多糖对T细胞和B细胞的刺激活性［16－17］。RBP和SBP都只在低剂量（50μg／mL）下刺激正常和LPS诱导的淋巴细胞增殖，且随剂量增加表现出明显的抑制作用，但两者在50～400μg／mL范围内随剂量增加显著促进ConA诱导的增殖（图4），说明RBP和SBP可能选择性刺激T细胞。研究枸杞多糖发现，蛋白含量相对高的LBP、LBPF4和LBPF5选择性刺激T细胞活化，但蛋白含量相对少的LBPF1、LBPF2和LBPF3却未表现出刺激作用，且LBP、LBPF4和LBPF5经蛋白酶酶解后对脾淋巴细胞增殖的刺激作用显著降低［18］。相反，刺五加多糖选择性刺激B细胞，而经蛋白酶消化结合蛋白后，多糖对脾淋巴细胞增殖的促进作用并未减弱［19］。由此推测，RBP、SBP及枸杞多糖的结合蛋白可能对T细胞激活有重要作用。此外，RBP和SBP还能显著增强巨噬细胞吞噬功能，但RBP明显抑制其NO生成，而SBP却随剂量减小逐渐增加其NO生成（图4和图5）。分析其原因可能是：RBP刺激巨噬细胞的M2极化，促进Th2应答，NO生成减少；而SBP刺激巨噬细胞M1极化，促进Th1应答，增加包括NO在内的炎症介质表达［16］。RBP和SBP均在体外表现出良好的脾淋巴细胞和巨噬细胞激活功能，其作用甚至强于5 μg／mL的ConA或LPS，作为免疫佐剂具有良好的开发应用前景。

4 结论

从米糠和豆粕中分离得到的粗多糖RBP和SBP均为组成复杂的蛋白多糖，其结构特征明显不同，差异主要涉及结合蛋白含量、单糖和氨基酸组成以及相对分子质量分布。在50～400μg／mL剂量范围内，RBP与SBP对小鼠脾淋巴细胞增殖的刺激作用相当，且效应细胞一致。RBP对巨噬细胞吞噬功能的增强作用要略强于SBP，而两者对其NO生成则发挥相反的作用。RBP和SBP在免疫调节活性上的异同与其结构特征密切关联，还需结合多糖的一级和高级结构特征以及多糖的作用受体类型进一步深入阐释。

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