河南省烟草赤星病病原鉴定

祖艳青，蒋士君，王海涛，孙淑君，张猛

1河南农业大学植物保护学院，郑州 450002；

2河南省农业科学院烟草研究所，许昌 461000

烟草赤星病(tobacco brown spot)是烟草生长后期主要的叶部病害，在世界各烟草产区均有发生[1]。我国在1916年首次在北京附近发现该病害，1964年在山东烟区大流行，损失巨大，随后此病在全国各烟区日趋严重[2]。烟草赤星病典型症状是叶片发病初期为褐色小斑点，以后逐渐扩大为1～2 cm，深褐色至赤褐色，圆形或不规则圆形，扩展中的病斑周围常有淡黄色晕圈，病斑具多重同心轮纹，病斑质脆易破。病害严重时，许多病斑相互连接愈合成大斑块枯焦[3]。

已报道的国内外相关研究对此病病原菌种的看法不一，最初报道该病害病原名称是Macrosporium longipes Ellis & Everhart (1892)，后来由 Mason（1928）将其组合为Alternaria longipes (Ell.& Ev.) Mason[4]，这个名称一直沿用到20世70年代。但Lucas 1971年著文认为 A.longipes与 A.alternata（Fr.：Fr.）keissler在形态上是相同的[5]。此后，研究烟草赤星病的大量文献中，就出现了A.alternata和A.longipes二名并用的混乱局面[5-8]。张天宇1998年将烟草赤星病菌鉴定为链格孢Alternaria alternata一个新的专化型Alternaria alternata (Fr.: Fr.) Keissler f.sp.nicotianae T.Y.Zhang et W.Q.Chen[9]。成巨龙，彭希文和关博元分别研究了陕西、云南和重庆地区的烟草赤星病菌，都认为主要病原菌为链格孢菌(A.alternata)，仅在云南存在少量长柄链格孢菌(A.longipes)，在陕西有少量Alternaria nicotianae[10-12]。Simmons和张天宇等链格孢鉴定专家经过多年的系统研究，完善了该属分类鉴定系统和标准，并对长柄链格孢菌(A.longipes)和链格孢菌(A.alternata)进行了比较研究，认为长柄链格孢菌(A.longipes)是明显区别于链格孢菌(A.alternata)等其他小孢子种的独立存在的种[13-14]。

关于河南省烟草赤星病菌的鉴定，目前尚未有较系统的分类研究，仅有康业斌，陈瑞泰等认为河南省烟草赤星病菌为Alternaria alternata[15-16]。对2011年和2012年河南省烟草赤星病病原的种类及其分布进行较系统全面的调查研究，按照国际标准鉴定并明确其病原种类，为防治研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种的采集与分离

2011～2012 年烟草生长中后期，分别在河南省南阳、三门峡、驻马店、许昌、洛阳、郑州六个市不同县的烟草生产区采集烟草赤星病菌典型病斑，在实验室内分离菌株。

1.1.2 供试培养基

PDA培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15 g，蒸馏水定容至1000 mL）；PCA培养基（马铃薯20 g，胡萝卜20 g，琼脂粉15 g，蒸馏水定容至1000 mL）。

1.1.3 供试烟草品种

测定菌株致病性统一用的是烤烟品种中烟100，采集大小较均匀一致的旺长期健康叶片，在实验室内做离体接种。

1.2 方法

1.2.1 菌种的分离

1.2.1.1 体视镜下直接挑取单个孢子

有些新鲜采集的标本可以直接在体视镜下挑取单个孢子进行分离；有些需要经过保湿培养2天左右才能挑取单孢。在无菌条件下挑取单孢到PDA平板后置生化培养箱中培养4～7天后，镜检保存纯菌种，将保存的菌种于4 ℃冰箱中长期保存。没有得到纯菌种的，重新单孢分离纯化，直至得到纯菌种。

1.2.1.2 组织分离法

用保湿培养方法挑取的单孢子并不能保证是病原菌，有时候可能是病斑上的腐生菌，此时，应结合组织分离方法获得病原菌相互验证。首先在病健交界处切下组织，放入75 %酒精消毒30 s，然后转入3 % NaClO消毒约2 min，用无菌水清洗3次，保证表面杂菌清洗干净，然后用灭过菌的滤纸将组织块表面的水吸干，再用无菌手术刀将组织切成约0.5 cm2大小的小块，分别放入PDA培养基平板上，在温度（25±1）℃、相对湿度（75±2）%、光照/黑暗各12 h交替的培养箱中培养。将分离菌株进行单孢纯化后，保存于4℃冰箱。

1.2.2 致病性测定

采集旺长期新鲜健康烟叶，用75 %的酒精棉球对烟叶表面消毒，无菌水冲洗3次。用直径为5 mm打孔器打菌块，将菌丝块轻贴于消过毒的烟叶表面，每片叶片以叶脉为分界，一边针刺另一边不针刺，针刺和未针刺分别接种10个位点。以同样大小的无菌PDA块作为对照接种于健康叶片上。接种后的烟叶置入消过毒的托盘内，叶柄处要用无菌湿棉花包上使叶片处于保湿状态，然后用保鲜膜封上托盘口，置于25℃室温培养箱内保湿培养5天，统计发病情况。

1.2.3 菌种的鉴定

1.2.3.1 形态鉴定

采用Simmons[14]鉴定链格孢属的标准方法，将单孢分离并且经柯赫氏法则验证的赤星病菌株接种到PCA平板上，置入培养条件为温度（25±1）℃、相对湿度（75±2）%、光照/黑暗各12 h交替的生化培养箱中培养5天，然后在无菌条件下刮掉PCA平板上面的菌丝，再次置入培养箱中培养2～5天，在体视镜下观察菌株的产孢表型，显微镜下观察分生孢子及分生孢子梗，产孢表型、分生孢子梗及分生孢子均拍照记录。

检测TAK-242与LFS-01协同作用对细胞活性的影响时，在JeKo-1细胞培养液中添加TAK-242，使其终浓度为0.5 nmol/L或1.0 nmol/L，之后以每孔3 000个细胞的密度将JeKo-1细胞铺于96孔板中，然后添加LFS-01（浓度同LFS-01单药组）。后续操作同上。

1.2.3.2 rDNA-ITS序列分子鉴定

在形态学鉴定的基础上，分别选取Alternaria alternata、Alternaria longipes、Alternaria yaliin fi ciens 3个种对应的代表菌株NC-110830-1-1、MC-110910-2-1、MC-110929-6-1的DNA为模板，以真菌核糖体基因转录间隔区ITS通用引物ITS1（5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G － 3'） 和 ITS4（5'-TCC TCC CGC TTA TTG ATA TGC－3'）两条引物进行PCR扩增反应。

PCR扩增反应体系：Taq PCR Master Mix (含0.1 U/μL Taq DNA polymerase，0.4 mmol/L each dNTP 2×Taq Buffer，PCR增强剂和蛋白质稳定剂，商品目录号: PT103）12.5μL，上游引物（5μmol/L）和下游引物（5μmol/L）各1μL，模板DNA（10 ng/μL）1μL，ddH2O为9.5μL，总体积为25μL。

rDNA-ITS基因PCR反应程序：先95 ℃预变性2 min，再 95 ℃ 30s→ 55 ℃ 30 s→ 72℃ 2min循环33次，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃终止。

将PCR产物经过电泳检测之后送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将供试菌株测序结果与GenBank中已发表的部分链格孢rDNA ITS区序列进行比较分析。

2 结果与分析

2.1 菌种的分离与致病性测定

从河南省南阳、三门峡、驻马店、许昌、洛阳、郑州六个市不同县的烟草生产区共采集烟草赤星病病斑典型标本300多份，分离得到85株链格孢属菌株。经室内离体叶片接种，发病菌株有60株，各发病菌株的发病症状相似，接种点由褐色斑点逐渐扩展成较规则褐色斑块，边缘多有黄色晕圈，且均从发病病斑再次分离到同一种菌株。图1为3种链格孢代表种菌株的接种发病症状图。

图1 烟草赤星病病原接种发病症状

2.2 烟草赤星病菌的形态学鉴定

2.2.1 链格孢 Alternaria alternata （Fr.：Fr.）keissler

在PCA培养基上培养5天，形成具多重分枝矮树状的分生孢子链，支链一般长1～5个孢子。分生孢子单生或短链生，卵形或椭圆形，淡褐色至褐色，具3～8个横膈膜和1～4个纵、斜隔膜。短喙柱状，淡褐色，部分转变为产孢细胞（假喙）。卵形分生孢子10～30×5～12 μm；椭圆形孢子25～35×4～9 μm。(图2)

2.2.2 长柄链格孢Alternaria longipes (Ell.& Ev.) Mason

在PCA培养基上培养5 d，形成的分生孢子链一般有10～15个孢子，多数分生孢子长链不分支，但有的也偶有分支，罕生的侧链一般较短（1～5个孢子）。分生孢子梗单生或簇生，有时会从产孢梗侧端延伸形成1～3条分支产孢梗，在分支梗上形成单独的分生孢子链。分生孢子倒棍棒形或卵形，12～38×8～16 μm，淡褐色至中褐色，成熟分生孢子具3～4个横膈膜，0～4个纵或斜隔膜。部分孢子顶端延伸形成长至50～60 μm的次生分生孢子梗（假喙），孢身和假喙分界较明显。(图3)

2.2.3 鸭梨链格孢Alternaria yaliin fi ciens R.G.Roberts

在PCA培养基上培养5天，形成分生孢子主链长8～18个孢子，每条主链有2～5个短分枝，每个短分枝有1～4个分生孢子。分生孢子多为卵形或椭圆形，顶部具次级分生孢子梗，少数为倒棍棒状或窄卵形，顶部逐渐变为锥形。在一个长链中几乎含有以上各种类型形状的孢子，在长链的下部孢子较大，上部的孢子较小。卵形的分生孢子，具3～4个横隔膜，1～3个纵或斜隔膜，表面光滑，20～30×10～12 μm。倒棍棒状的分生孢子30～50×8～13 μm。（图4）

图2 链格孢的产孢表型，分生孢子梗及分生孢子

图3 长柄链格孢的产孢表型，分生孢子梗及分生孢子

图4 鸭梨链格孢的产孢表型，分生孢子梗及分生孢子

2.3 ITS序列分子鉴定结果

3个供试菌株NC-110830-1-1、MC-110910-2-1、MC-110929-6-1 分别扩增出575、575、572 bp的单一片段，将所得序列两端引物及部分的18S和28S序列剪去后得到5.8S rDNA-ITS区完整序列，片段均为480 bp的一条特异性条带。

将供试菌株测序结果与在GenBank中搜索的Alternaria alternata（菌株E.G.S 34-016，GenBank接受号为FJ717729.1）、 Alternaria longipes(菌株E.G.S 30-033,GenBank接受号为AY751457.1) 和 Alternaria yaliin fi ciens（菌株R.G.R 01.0204,GenBank接受号为FJ717729.1）的rDNA-ITS序列进行比对分析，发现GenBank中搜索的三个菌株的5.8S rDNA-ITS序列完全一致，供试菌株NC-110830-1-1、MC-110910-2-1与搜索的序列相似度也高达100%，仅有菌株MC-110929-6-1的序列5.8S区位点173处由A→C，其他位点完全一致。说明在形态上鉴定为不同种的小孢子链格孢种的5.8S rDNA-ITS序列过于保守，不能用于这些种的鉴定。

3 结论与讨论

实验结果表明，河南省烟草赤星病菌组成复杂，目前至少有3个种，分别是Alternaria alternata、Alternaria longipes、Alternaria yaliinficiens。其中Alternaria alternata 在已报道的关于烟草赤星病菌的文献中是较常见的种，而Alternaria longipes较少有报道，特别是Alternaria yaliin fi ciens至今未见有寄生在烟草上的报道。

链格孢属真菌属级特征醒目，而种级特征随条件变异较大，特别是小孢子链格孢种的准确鉴定比较困难，在病原鉴定时必须先进行单孢分离、纯化后严格的按现代链格孢分类国际标准方法才能准确鉴定[13-14]。

在分子水平上，Alternaria alternata、Alternaria longipes、Alternaria yaliin fi ciens在 5.8S rDNA-ITS区域序列都没有明显差异，说明它们在遗传上是很接近的自然群体。这与王洪凯（2001）、胡中会（2012）等报道的结果一致[17-18]，因此5.8S rDNA-ITS区域不适合小孢子链格孢种的分子鉴定。在以后的研究中需要继续筛选合适的基因来区分链格孢属不同的种。

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