库普弗细胞与非酒精性脂肪性肝病关系的研究进展

黄 超，陈源文，徐雷鸣

1.上海交通大学医学院附属新华医院消化内镜诊治部，上海200092;2.上海市小儿消化与营养重点实验室

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种无过量饮酒史，以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征，主要包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、脂肪性肝纤维化和肝硬化。单纯的肝脂肪变性虽是NAFLD的良性表现，但很多病例仍可进展成为脂肪性肝炎甚至肝硬化、肝细胞癌。然而，其发病机制尚未完全明确。

库普弗细胞(Kupffer cells，KCs)位于肝窦内，可第一时间接触随入肝血流而来的各种物质分子，其主要作用为吞噬、清除固体颗粒;处理并递呈抗原激发获得性免疫;分泌炎症介质，募集炎症细胞使之在肝脏聚集等。最近发现肥胖患者脂肪组织与肝组织的共同病理变化可归因于巨噬细胞的作用，而且越来越多的证据表明库普弗细胞在NAFLD进展过程中发挥了决定性的作用。

1 KCs与脂质沉积

有研究显示，肥胖、2型糖尿病、高脂血症等伴随的瘦素及胰岛素抵抗，可引起呈良性经过的肝内脂肪堆积(单纯性脂肪肝)。Huang等［1］报道KCs干扰肝细胞脂质代谢以及对胰岛素的敏感性，这一作用可能主要由肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor，TNF-α)介导。研究发现，抑制KCs可对抗饮食诱导的胰岛素抵抗和肝脂肪变性;TNF-α缺失或TNF-α受体缺失的肥胖小鼠对胰岛素的敏感性较对照组提高［2］。而KCs是肝脏局部TNF-α的主要来源。可见，KCs在胰岛素抵抗相关的脂肪沉积起重要作用。然而，KCs在NAFLD的早期可能并不起关键作用。Li等［3］对Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)野生型和TLR4敲除小鼠静脉注射三氯化钆抑制后，饲以高脂饮食。结果显示，抑制KCs对TLR4野生型小鼠肝脏甘油三酯沉积、肝内游离脂肪酸的浓度下降和早期血清ALT改善均不明显。

肝组织脂质成分及其含量的改变也可通过若干机制调节库普弗细胞的生物学活动。脂肪堆积的肝细胞占据肝内空间，致肝窦灌流不足，白细胞被困在狭窄的肝窦内，使库普弗细胞参与微血管炎症反应的可能性增加［4］。库普弗细胞过度暴露于脂肪酸后可通过细胞表面受体及胞内介质来调节炎症和胰岛素抵抗通路［5］。过多或异常的脂质会干扰机体对脂肪变肝细胞的识别，从而促进脂肪变肝细胞与库普弗细胞之间发生不利的相互作用［6］。

2 KCs在单纯性脂肪肝进展为脂肪性肝炎过程中的作用

2.1 KCs与 TLR4 Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)是一种Ⅰ型跨膜受体，可通过识别和介导病原相关分子模式和结合内源性配体，从而激活细胞内信号转导机制，进一步导致炎症发生。TLR家族包括多个成员，其中与NAFLD密切相关的是TLR4。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)/内毒素能够作为配体与 TLR4相结合，随后通过TLR4的胞内TIR(Toll/IL-1 receptor)结构域与骨髓分化因子88(MyD88)的羧基端相结合，促进 c-Jun氨基端蛋白激酶(INK)和核因子-κB(NF-κB)等转录因子表达，从而引起一系列炎性细胞因子和化学因子的释放，如白细胞介素IL-6、IL-1、IL-8、IL-12、IL-18 和 TNF-α。IL-6、IL-1 和 IL-8 可激活并促使中性粒细胞、单核/巨噬细胞、自然杀伤细胞等炎症细胞到达炎症部位。此外，游离脂肪酸也能作为TLR的配体，经TLR4/MyD88信号通路，促使炎症因子的释放［7］。

肝内TLR4主要位于KCs细胞表面。Ye等［8］明确指出肝巨噬细胞TLR4的激活是脂肪性肝炎发生的关键步骤。Soares等［9］也认为TLR4是内毒素最重要的受体，它是酒精性肝病和非酒精性肝病发生肝脏炎症的关键介质。X盒结合蛋白1(X-box binding protein-1，XBP-1)是重要的转录因子，可直接与炎症基因(TNF-α、IL-6)的启动子区域相互作用，其作为 TLR4的下游效应器，在高脂高胆固醇饮食诱导的肝脏炎症和损伤过程中发挥作用。Ye等［8］在其研究中发现，腺病毒介导的XBP-1表达沉默对高脂高胆固醇饮食诱导的肝脂质沉积并无影响;而引起NF-κB激活减弱、细胞因子产生减少、肝损伤减轻等现象，提示XBP-1主要参与单纯性脂肪变向脂肪性肝炎的转变。另一重要发现:TLR4表达上调的同时伴有脂质过氧化产物的增加，说明LPS与TLR4的相互作用还可引起氧化应激。Ye等［8］还指出 TLR4与活性氧(reactive oxygen species，ROS)之间存在正反馈调节，对炎症的起始和扩大起重要作用。用抗氧化剂或TLR4基因抑制剂处理原代KCs后，LPS无法诱导其炎症反应，该结果为以上观点提供了有力依据。因此，有理由认为TLR4与ROS两条信号通路在XBP-1汇合，从而加强炎症反应。此外，Miura等［10］在其建立的小鼠NASH模型中，发现TLR9信号通路可促使KCs分泌IL-1β，从而导致肝脂肪变、炎症，甚至纤维化。

2.2 KCs的经典/替代激活 目前已证实有不同巨噬细胞亚型的存在，最具特征性的巨噬细胞是经典激活巨噬细胞(classically activated macrophages，caMφ)，其可在辅助性T细胞1型(Th1)分泌因子(γ-干扰素和肿瘤坏死因子)环境中被细菌脂多糖及炎性物质和(或)微生物激活。同时，巨噬细胞在Th2细胞因子环境中发育成为一种不同于caMφ激活程序的巨噬细胞，这种类型被称为替代激活巨噬细胞 (alternatively activated macrophages，aaMφ)。现有研究显示，非肥胖小鼠脂肪组织巨噬细胞为M2表型，而肥胖小鼠巨噬细胞呈现 M1 表型［11］。

2.2.1 KCs的经典激活:M1/经典激活巨噬细胞擅长递呈抗原，诱导细胞因子(IL-6、IL-12、TNF-α、IL-23)的大量释放，激活Th1应答(促炎);M1巨噬细胞还能产生ROS［11］。已知LPS能诱导KCs发生经典激活。Huang等［1］采用LPS和游离脂肪酸处理与KC共培养的肝细胞和单独培养的肝细胞(KCs与肝细胞从同一大鼠肝脏分离所得)，随后分析肝细胞内脂质代谢情况和胰岛素生理作用。结果显示，当与KC共培养时，肝细胞内甘油三酯增多，脂肪酸酯化增加，脂肪酸氧化减少;而单独培养的肝细胞在相同处理后，其甘油三酯聚集，脂肪酸酯化和脂肪酸氧化几乎没有变化。胰岛素可促使胰岛素受体磷酸化及丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化，激活胰岛素受体底物-1(IRS-1)和磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)活性，而KCs的M1型激活导致胰岛素以上功能明显下调。以上研究结果说明:KCs在NAFLD发展过程中发挥了重要作用。这同时也说明，KCs与肝实质细胞之间的相互作用在调节肝代谢方面至关重要。

2.2.2 KCs的替代激活在NAFLD中的作用:M2/替代激活巨噬细胞由IL-13和IL-4诱导产生，促进Th2应答(抗炎);M2巨噬细胞高表达抗炎细胞因子IL-1和IL-10受体。因此，与巨噬细胞经典激活相反，巨噬细胞替代激活代表了一条重要的炎症反应消散通路。Kang等［12］发现脂肪细胞和肝细胞是Th2细胞因子的重要来源。Th2细胞因子促使过氧化物酶体增殖物激活受体 δ (peroxisome proliferator-activated receptor δ，PPARδ)作用于巨噬细胞，使其发生替代激活，这对减轻白色脂肪组织和肝脏炎症非常重要，而这一重要的调节环路在肝脂肪变时发生改变［13］。饱和脂肪酸可与TLR4结合促进巨噬细胞的M1型(促炎)激活［14］;而单不饱和脂肪酸可通过PPARδ促进巨噬细胞替代激活［15］，NAFLD时因脂质内稳态和肝细胞微环境改变，此调节作用同样失衡［3］。也就是说，NAFLD发生后巨噬细胞替代激活受抑制，无法发挥其促进炎症消退的作用。

近年来，许多研究证明PPARδ在介导巨噬细胞替代激活中发挥重要作用。Odegaard等［13］在其研究中发现:(1)非肥胖动物敲除PPARδ基因后，替代激活KCs标记物表达下调;(2)将PPARδ-/-骨髓移植到野生型小鼠可减少替代激活KCs，从而导致肝细胞线粒体功能障碍和胰岛素抵抗;(3)PPARδ-/-巨噬细胞与原代肝细胞共同培养后，明显抑制了肝细胞氧化代谢。Kang等［12］报道髓细胞特异性 PPARδ-/-小鼠可出现脂肪细胞功能紊乱、胰岛素抵抗、肝脂肪变性。Huang等［1］也认为PPARδ缺失使肥胖人群更易发生胰岛素抵抗、肝脂肪变性、肝细胞氧化代谢降低。这些重要发现不禁让人猜想，是否可以通过加强PPARδ对KCs的特定靶向作用，引起KCs替代激活，从而改善NAFLD炎症反应和脂肪变性。

2.3 KCs功能障碍 Asanuma等［16］报道通过超顺磁氧化铁(SPIO)磁共振成像技术发现，在KCs数目不减少的情况下，NAFLD患者和NASH动物模型中KCs吞噬功能明显受损，且其功能受损程度与肝脂肪变性程度呈正比。该发现提示，KCs对LPS及其他有害分子清除障碍可加重肝损伤，这一机制也需在NAFLD发病中受到关注。

研究表明，肠源性内毒素血症可能是NAFLD发生发展的一个重要原因。肝细胞膜上有内毒素及LPS类脂A受体，所以内毒素可与其受体结合直接作用于肝细胞引起肝脏损害。但脂肪性肝病时，内毒素对肝脏的损害主要通过TLR4激活KC，促进TNF-α等多种细胞因子和化学因子的转录、合成与释放，引起肝脏的炎症损害［17］。内毒素还可激活补体系统，使其释放过敏毒素C3a和C5a，后两者分别与KCs上相应受体(C3aR、C5aR)结合而激活 KCs［18］。

KCs作为入肝血流的第一道防线，其摄取功能减弱，不仅使体循环内毒素水平增高，而且持续刺激KCs来源细胞因子(TNF-α、IL-β)过度产生，从而不断放大内毒素的作用。

2.4 其他 壳丙糖酶(Chitotriosidase，CHIT)主要由活化巨噬细胞产生;在肝脏，其只表达在 KCs。Malaguarnera等［19］发现NASH 患者 KCs中 CHIT表达明显高于单纯性脂肪肝患者，且CHIT表达水平与NASH严重程度呈正比。因此，不妨大胆假设CHIT可能会成为NASH疾病严重程度新一代标记物。

3 KCs与脂肪性肝纤维化

Yang等［20］在其建立的脂肪性肝纤维化模型中发现肝内源性大麻素水平明显增高，而该种物质的升高与肝纤维化发生和肝内阻力的增加有关。用三氯化钆抑制KCs，可减少内源性大麻素的生成。Yang等［20］所建立的模型除了有典型高瘦素血症外，还伴有活化白细胞增加以及TNF-α/p38MAPK表达上调。高瘦素血症可引起白细胞激活，活化白细胞通过TNF-α/MAPK通路释放内源性大麻素。有文献报道瘦素可通过p38MAPK通路增加 KCs对 TNF-α的分泌［21］。因此，高瘦素血症很可能与内源性大麻素的增高有关，而KCs或许参与了瘦素对肝内源性大麻素的调节，但其具体机制还有待进一步的研究。

Malaguarnera等［19］报道，单纯性脂肪肝患者和NASH患者KCs的 CHIT mRNA水平与氧离子、脂质过氧化反应、TNF-α及铁蛋白水平显著相关。此外，受检人员中肝脏铁沉积最严重的患者其CHIT表达也最高。美国NASH临床协作网对849例资料完整的NAFLD患者进行肝活检标本铁染色发现，293例(34.5%)患者有铁沉积，其中63例为肝细胞模式、91例网状内皮系统模式、139例混合模式铁沉积。网状内皮系统模式较其他模式铁沉积患者，肝细胞气球样变、汇管区炎症、NASH及其进展性肝纤维化更常见，内皮网状系统铁沉积与进展性肝纤维化的相关性独立于年龄、性别、BMI和 DM［22］。因此，继发性铁沉积与KCs之间存在何种联系，又在NAFLD中发挥何种作用，值得研究。

4 KCs对NAFLD肝脏再生的影响

业已证实TNF-α和IL-6是肝脏再生早期信号通路的重要信使，而这两者都由KCs分泌。另一方面，促进TNF-α生成的因素大都加剧肝损伤，而TNF-α的抑制剂则具有保肝效果［23］;Hsiao等［24］在其研究中发现NAFLD模型肝再生能力减弱，肝细胞功能恶化，这可能与KCs介导细胞因子如 TNF-α、IL-1、IL-10等表达紊乱相关。因此，KCs在NAFLD肝再生方面的作用仍存在争议。

5 结语

尽管近年来NAFLD领域的研究已经取得一定进展，但目前对NAFLD发病机制了解仍十分有限。KCs虽然已经证实是参与NAFLD进展的重要细胞，但目前对其在NAFLD中的功能仍需要系统研究，加深认识和减少争议，最终不仅有利于NAFLD机制进一步阐明，还为NAFLD防治提供新的研究思路和靶点。

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