一种快速检测食用油中黄曲霉毒素B1的胶体金试剂板的研制

陈笑笑 桑丽雅 李 康 胡叶军 盛慧萍

（杭州南开日新生物技术有限公司1，杭州 310022）

（杭州市质量技术监督检测院2，杭州 310022）

黄曲霉毒素（Aflatoxins）是20世纪60年代初发现的一种真菌有毒代谢产物，其基本结构由一个二呋喃环和一个氧杂萘邻酮组成（即香豆素），主要成分包括 6种：即 B1、B2、G1、G2、M1、M2［1－2］。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。在天然污染的食品中，以黄曲霉毒素B1（AFB1）最为多见，其毒性和致癌性也最强。生产企业如果使用劣质的原料，如发霉的花生、菜籽、玉米等生产食用油，则有可能造成黄曲霉素超标，对消费者的身体健康造成威胁。

黄曲霉毒素危害性大，存在范围广，黄曲霉毒素B1对农产品的污染，不仅影响了农产品质量，严重威胁到人民消费安全和身体健康，还降低了农产品的市场竞争力，影响农产品市场声誉。为了预防黄曲霉毒素中毒事件的发生，维护人类健康，几乎所有国家和地区都规定了农产品、食品和饲料中AFB1的最大允许含量，并作为强制性检测项目［3－4］。

目前，测定食品中黄曲霉毒素的方法有薄层层析法、液相色谱法、放射免疫分析法、酶联免疫法、免疫层析法、微柱筛选法、金标试纸法等。这些检测方法大多需要专门的仪器设备并且操作繁琐，无法满足现场快速检测的要求，而且检测成本较高。自乳业中被检出黄曲霉毒素M1事件后，据质检总局公布的食用植物油产品抽查情况，广州、深圳等多家食用油厂家生产的食用油产品被检出致癌物质黄曲霉毒素超标。因此，建立简单、快速、高效的食用油中AFB1检测方法具有重要的意义。［5－6］

本试验以单克隆抗体（McAb）和免疫胶体金标记技术（ILT）为基础，研制了一种食用油中AFB1免疫胶体金快速检测试剂板，可一步式定性测定食用油中AFB1。试剂的灵敏度等性能优于现有的黄曲霉毒素免疫胶体金快速检测试剂，具有简单、快速、灵敏度高、无须辅助仪器设备等优点，适用于大量样品的初步筛选和现场快速检测。［7］

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

BioJet XYZ3000型点膜仪：美国BioDot公司；硝酸纤维素膜（NC）、胶体金结合垫、样品垫、吸水垫：Millipore公司；Bradford蛋白定量试剂盒：Bio－Rad公司；黄曲霉毒素ELISA检测试剂盒：美国Beacon公司；酶标微孔：美国Corning公司。

1.1.2 药品和试剂

氯金酸（HAuCl4·4H2O）、黄曲霉毒素 B1标准品、羊抗鼠IgG：Sigma公司；甲醇、正己烷：华东医药有限公司；黄曲霉毒素 B1－牛血清蛋白偶联物（AFB1－BSA）、抗黄曲霉毒素单克隆抗体：杭州南开日新生物技术有限公司实验室。

1.2 方法

1.2.1 黄曲霉毒素B1特异性结合抗原的制备及鉴定

1.2.1.1 通过衍生化反应，合成AFB1羧甲基活化物

10 mg AFB1溶于6 mL［（V（甲醇）∶V（水）∶V（吡啶）＝4∶1∶1）］混合液中，加入 20 mg羧甲基羟胺半盐酸盐，85℃回流3 h，室温放置过夜，旋转蒸发仪减压蒸除溶剂。

所得沉淀物用少量氯仿溶解，以V（氯仿）∶V（甲醇）＝9∶1为展开剂，与标准AFB1的展开值Rf进行对照，Rf值为0.25左右的是AFB1的活化物，Rf值为0.75左右的组份是没有转化的AFB1，收集活化物组份，待第二次薄层层析进行纯化。收集AFB1活化物，用少量的甲醇溶解，待用。

1.2.1.2 利用碳二亚胺法合成AFB1完全抗原

取AFB1活化物5 mg于5 mL的磨口烧瓶中，加5 mL无水二甲基甲酰胺（DMF）溶液使其溶解，置于4℃冰箱中冷却，取50 mg碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶于1.0 mL蒸馏水中，取44 mg BSA溶于4.0 mL 0.01 mol／L磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中，冰箱中冷却待用。

在磁力搅拌的同时，将0.5 mL EDC溶液逐滴加入AFB1溶液中，4℃搅拌。避光反应1 h。在反应液中缓慢滴加BSA溶液，继续搅拌反应1 h后，再加入0.5 mL EDPC溶液，4℃下反应16 h。将产物溶液用0.01 mol／L PBS溶液在4℃下透析72 h，每12 h换透析液1次，用小瓶分装，真空冷冻干燥后，置4℃保存。1.2.1.3 抗原的鉴定

合成的黄曲霉毒素特异性结合抗原（AFB1－BSA）稀释成100μg／mL（蛋白质量浓度），然后做200～400 nm波长的紫外扫描。比较半抗原、载体蛋白和偶联物的紫外光谱图，判断偶联是否成功。

1.2.2 抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备按常规方法制备［8］。

1.2.3 金标抗体的制备

1.2.3.1 胶体金溶液的制备

柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液：取0.01%氯金酸水溶液100 mL用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠水溶液2.5 mL，继续搅拌加热10 min，溶液呈透亮的红色。室温冷却，用去离子水恢复到原体积，4℃保存备用。

1.2.3.2 黄曲霉毒素B1单克隆抗体的标记

取已制备好的胶体金溶液100 mL，用0.1 mol／L碳酸钾溶液调pH到8.0。边搅拌边加入黄曲霉毒素B1单抗2 mg，搅拌15 min，逐滴加入2.5 mL 25 mg／mL聚乙二醇 20 000（PEG 20 000），搅拌 20 min。20 000 r／min离心20 min，弃上清液，加入 10 mL pH 7.4 PBS缓冲液（含0.4 mg／mL PEG）清洗2次。将沉淀用5 mL质量分数为2%BSA的PBS缓冲液（pH 7.4）溶解，用0.22μm无菌过滤器过滤后，4℃保存备用。

1.2.4 T线、C线工作浓度的确定及C线、T线、金标抗体包被量配比的确定

1.2.4.1 T线工作浓度的确定

将包被抗原AFB1－BSA用稀释液稀释成系列工作浓度，按常规喷量1.0μL／cm包被到NC膜上作为T线，同时将羊抗鼠IgG稀释成1.2 mg／mL按常规喷量1.0μL／cm包被到NC膜上作为C线，上述NC膜烘干后与胶体金结合垫等组装成试纸条，用0.01 mol／L pH 7.4的PBS滴定，观察T线显色强度及显色稳定性情况，通过对T线的工作浓度的粗调至细调，最终确定T线的工作浓度范围。

1.2.4.2 C线工作浓度的确定

根据T线工作浓度范围，将羊抗鼠IgG设置系列浓度按常规喷量1.0μL／cm包被到NC膜上作为C线，与胶体金结合垫组装后，用PBS液滴定，选择C线显色深度适中、比T线略浅或与T线一样深的浓度作为C线工作浓度。

1.2.4.3 C线、T线、金标抗体包被量配比的确定

在T线工作浓度范围内，选择一个适中浓度按常规喷量1.0μL／cm包被到NC膜上作为T线；将确定的C线工作浓度以常规喷量1.0μL／cm包被到NC膜上作为C线；将金标抗体包被到金标微孔中，包被量在0.8～2.0μL／cm范围内设置系列浓度；上述材料组装成试纸条后，用PBS液和不同浓度的黄曲霉毒素B1标准品液滴定，根据显色情况和试纸灵敏度，选择适宜的金标抗体包被量。

确定了金标抗体包被量后，再细调C、T线包被浓度配比，最终确定C线、T线及金标抗体的包被量配比。

1.2.5 试剂板各组分的优化、组装

用点膜机把适当浓度的AFB1－BSA及羊抗鼠IgG喷在NC膜上，分别作为检测线（T）和控制线（C），在33℃烘箱干燥12 h。将制备好的金标记抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体包被到微孔中，33℃烘箱干燥12 h。

检测试剂板由PVC背衬，及其上按顺序黏着的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫（图1）组成。用切割机将贴好的板切割成3.84 cm宽的条，装入模板中制成检测试剂板，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。

图1 黄曲霉毒素免疫胶体金快速检测试剂板结构示意图

1.2.6 试剂板的操作方法

1.2.6.1 样品制备

样本处理过程：吸取1 mL食用油于5 mL离心管中；加入1 mL正己烷和1 mL甲醇，剧烈震荡1 min，静置1 min（明显分层）；吸取0.5 mL上层溶液于一新的5 mL离心管中，60℃下空（氮）气吹干。向吹干的离心管中加入2.5 mL黄曲霉毒素B1专用复溶液，冲洗管内壁，充分溶解残留物后，待检。

1.2.6.2 使用方法

吸取100μL待检样品溶液于已包被了金标的微孔中，用滴管吹打均匀，静置反应5 min，吸取全部混合溶液于试剂板加样孔中，加样后开始计时，结果应在5～8 min读取，其他时间判读无效，读取结果时，试剂板应置于观察者正面，如图2右侧所示。

图2 试剂使用方法

1.2.6.3 结果判定

当检测试样滴于加样孔时，由于毛细作用液体向前移动。到达T线时，试样中的黄曲霉毒素B1与固定在T线上的AFB1－BSA复合物竞争结合抗黄曲霉毒素B1单抗－胶体金复合物，可出现以下几种情况（图3）。

图3 阴阳性结果判定图

1.2.7 试剂板灵敏度的测定

添加黄曲霉毒素B1标准品溶液制备成不同质量浓度的分析试样溶液：0、0.2、0.5、1、2、3μg／L，用检测试剂进行测定，每个试样做3个平行样，5 min后观察结果。

1.2.8 试剂板特异性的测定

将黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素B、玉米赤霉烯酮、伏马菌素分别溶于PBS缓冲液（pH 7.4，0.01 mol／L），各配成5、10、20、50、100μg／L的质量浓度，然后用检测试剂板检测。

1.2.9 试剂板假阳性率和假阴性率测定

经HPLC法［9］检测为黄曲霉毒素B1阴性（黄曲霉毒素B1含量均小于0.1μg／L）和阳性添标样品（黄曲霉毒素B1含量均大于0.5μg／L）的食用油样品各50份，用本研究制备的试剂板进行测定，比较检测结果。

1.2.10 试剂板稳定性测定

用来自同一批次中的不同检测试剂板检测同一样品，比较检测结果。

将相同批次的试剂板分别于33℃、室温、4℃密闭保存3个月，每隔2周分别检测阳性和阴性水产样品各20份。

1.2.11 试剂板与仪器方法的比对

将10份不同的油样用本研究制备的试剂板进行检测，同时用HPLC法进行对比。

2 结果与分析

2.1 黄曲霉毒素特异性结合抗原的鉴定

AFB1、BSA和AFB1－BSA的紫外扫描图谱见图4。从图谱分析，偶联后AFB1－BSA的特征吸收波峰发生偏移，根据吸光度加合性原理，表明偶联成功。

图4 AFB1、BSA和AFB1－BSA的紫外扫描图谱

2.2 检测试剂板的制备

将不同质量浓度的AFB1－BSA、羊抗鼠IgG、黄曲霉毒素B1单克隆抗体－胶体金复合物分别包被在硝酸纤维素膜和酶标微孔中，反复调试，使最终的灵敏度达到检测所需的要求。其具体用量如下：黄曲霉毒素B1单克隆抗体－胶体金复合物采用OD值为10（包被量10μL／孔）的包被量，检测线 AFB1－BSA用量为 0.8 mg／mL（喷量1.0μL／cm），控制线羊抗鼠IgG用量为1 mg／mL（喷量1.0μL／cm）。

试验结果表明：①采用不同 pH值 5、6、7、8、9、10的样品垫对试剂板的灵敏度没有产生明显影响。②将硝酸纤维素膜用各种不同配比的溶液做封闭，发现试剂条的C、T线显色都变浅，但对灵敏度和特异性没有明显影响，所以最终制备检测试剂时没有采用封闭的方案。③经过比较发现，若C、T线的质量浓度和喷量以及抗体－胶体金复合物的OD值相同，采用12μm和5μm这两种不同孔径的硝酸纤维素膜，后者做成的试剂板灵敏度更高一些。④在制备好的抗体－胶体金复合物中加入不同比例的蔗糖和海藻糖，会对胶体金复合物从胶体金结合垫上的释放能力产生影响，在一定范围内，加入的蔗糖和海藻糖的比例越高，胶体金复合物释放得越快。

采用半抗原偶联率比较高的AFB1－BSA做成的试剂板灵敏度更高，这同偶联比率高的AFB1－BSA与黄曲霉毒素B1单克隆抗体－胶体金复合物发生反应的能力更强有关。但如果半抗原偶联率过高，则会出现线条过细，显色梯度不明显，跑板差等现象，不适用于检测试剂板的研制。

本试剂板采用的检测操作过程中，对比三氯甲烷、乙腈、甲醇、乙酸乙酯等常规提取剂，发现甲醇的提取效率较高，价格便宜，且毒性及对环境的影响较其他试剂小很多，适用于本试剂板的样本提取。样本提取过程尽量避免使用比较昂贵仪器，采取尽可能简洁的步骤。通过反复试验，本试剂板最终采用提取、吹干、复溶的提取方法，通过浓缩提高了试剂板的检测线。针对不同使用者所需的检测线各异，本方法中可以通过增加复溶液量，降低试剂板的检出线。根据使用复溶液量的梯度建立试剂板的检测线梯度，使同一试剂板可以具有不止一个检测线。

2.3 检测的灵敏度

不同质量浓度的分析试样溶液经试剂板检测，检测显色结果如图5所示，从图5可以看到随着添加质量分数的升高，检测线（T线）显色强度呈梯度递减。当试样中AFB1质量浓度小于0.5μg／L时，检测线显色比控制线深或与控制线在肉眼下没有明显区别。当试样中AFB1质量浓度大于等于0.5μg／L时，检测线显色比控制线浅。当试样中的AFB1浓度大于2μg／L时，检测线完全消失。

由此初步确定，本检测试剂板对食用油中黄曲霉毒素B1的最低检测水平（LDL）可达到0.5μg／L。

图5 不同浓度标准品滴板后显色变化图

2.4 检测的特异性

检测结果见表1，由表1可知，试剂板只针对AFB1有特异性结合，与其他真菌毒素没有交叉反应。

表1 黄曲霉毒素B1快速检测试剂板的特异性

2.5 假阴性率和假阳性率

50份经HPLC法确证阴性的食用油样品用本研究制备的试剂板检测，2个样品检测结果为阳性，其余48个样品检测结果为阴性，故试剂板的假阳性率为4%。

50份经HPLC法确证黄曲霉毒素B1含量大于0.5μg／L的食用油样品用本研究制备的试剂板检测，检测结果显示均为阳性，故试剂板的假阴性率为0。

2.6 试剂板的稳定性

经验证表明，不同批次的检测试剂板测定同一样品，其检测限、控制线的显色时间及颜色深浅和最终结果判读基本相同。

试剂板分别于33℃、室温、4℃密闭保存3个月，每隔2周分别检测阳性和阴性水产样品各20份，结果显示随着时间和温度的变化，检测结果均未发生显著变化。根据33℃下一天相当于室温下1周计算，本试剂板可以在室温下保存12个月［10］。

2.7 试剂板与仪器方法的比对结果

10份油样经本研究试剂板（GICA法）和HPLC法检测，结果见表2，两种方法结果一致。

表2 GICA和HPLC检测结果的比较

3 结论

本研究研制的检测试剂板，与其他的检测手段相比，最大的特点是快，可以在20 min内得到结果；整个检测过程无需接触毒性很大的黄曲霉毒素；操作方便，可实现单个样本检测；检测成本低廉。作为一种快速筛查检测的方法，有利于食品中黄曲霉毒素B1的检测和监控，具有重要价值。

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