人肠道病毒分型方法和鉴定技术的研究进展

张晓玲，胡芸文，周志统

上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心，上海 201508

人肠道病毒(human enterovirus，HEV)属小RNA病毒科(Picornaviridae)中肠道病毒属。病毒为单股正链RNA，大小约7.5 kb。病毒的结构蛋白为VP1～4，VP1～3位于病毒表面，其抗原决定簇决定肠道病毒血清型，而VP4在病毒内部。

HEV主要通过粪-口途径传播，少数也经呼吸道传播，可引起多种不同临床表现的疾病，包括发热、腹泻、出疹、无菌性脑膜炎、脑膜脑炎、心肌炎、肺水肿和急性弛缓性麻痹(acute flaccid paralysis，AFP)等[1]。近年来，一些研究表明HEV还与慢性病如1型糖尿病[2,3]等相关。

1 HEV的分型方法

1.1 传统分型法

传统的HEV分型主要基于病毒分离和抗血清中和试验。柯萨奇病毒 (coxsackievirus, CV)的分离是将呼吸道和粪便标本等接种于哺乳动物细胞，待产生细胞病变后，通过抗血清中和试验进行血清型定型[4]。这种方法将HEV分为64种血清型，包括脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)1～3，柯萨奇病毒A组(coxsackievirus A,CVA)1～22、CAV24和柯萨奇病毒B组(coxsackievirus B,CVB)1～6，埃可病毒(echovirus,ECV)1～7、ECV9、ECV11～21、ECV24～27、ECV29～33和HEV68～71。

1.2 基因分型法

随着分子生物学的发展，基于病毒核苷酸序列分析的分型方法越来越多地被应用。这种方法是根据病毒的分子特点进行分型。1970年国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)将脊髓灰质炎病毒﹑柯萨奇病毒和埃可病毒之后被发现的HEV按序号命名。参考ICTV小RNA病毒组的最新数据，2000年至今已发现40余种新型HEV，最新序号到了HEV-A119 (http://www.picornastudygroup.com/types/enterovirus/ev_types.htm)。

1.2.1基于VP1序列分析定型1999年，Oberste等[5]对HEV VP1区核酸序列进行研究，建立了根据VP1基因序列分析来鉴定HEV型别的方法。他们通过对47株HEV血清型原型株和10株抗原变异株的VP1全长序列测序，联合GenBank中可利用的序列，构成了一个包含66种HEV原血清型和另外7种血清型的VP1序列数据库，用这些VP1序列建立的系统发生树，将HEV分为A～D组。另外，根据被鉴定的核苷酸序列与数据库中所有HEV血清型参考株的核苷酸序列比对的结果，制订了如下分型规则：如被鉴定的毒株与同源性最高的参考株序列相似性>75%，且与同源性第2的参考株相似性<70%，该毒株与同源性最高的参考株为同一型；如与同源性最高的参考株序列相似性<70%，则区分为不同的HEV型别；如与同源性最高的参考株序列相似性<75%或与同源性第2的参考株相似性>70%，则有待进一步确定。由此，原HEV22、HEV23型被独立划为一个新的小RNA 病毒属：双埃可病毒(parechovirus)，分别称作HPeV 1型(HEV22)和 HPeV2型(HEV23)，至今已确认的双埃可病毒有14种，包括HPeV1～14 (http://www.picornastudygroup.com/)。近年的研究认为，人双埃可病毒可能是导致一些婴幼儿严重临床并发症的病原体[6,7]。

2001年，Caro等[8]设计了一对引物，可扩增肠道病毒1 452 bp的基因片段，跨越VP1的3′端、2A、2B和2C 5′端的部分区域。通过对聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)产物测序，鉴定出64株原型株中的59个型，并对45株不同来源的分离株和6株用血清学方法未能定型的病毒株进行了分型。根据建立的系统发生树，他们还将HEV分为5个亚组，形成了一个新的HEV分类方法。

总之，VP1序列分析定型的特点是与中和试验结果的一致性较好，结果准确、可靠，是HEV分子分型最常用的方法。

1.2.2基于VP4序列分析定型Chu等[9]对1998年台湾暴发的手足口病做流行病学调查时，采用VP4全长序列建立了HEV的定型分析方法，其结果与基于VP1序列的定型方法有较高的符合率。2002年Kubo等[10]对6份手足口病伴无菌性脑炎的病例标本尝试HEV分型，也采用了对VP4序列分析的方法，结果与血清学检测方法一致。

VP4全长序列仅有207个核苷酸(nucleotide, nt)，比VP1基因序列(834 ～ 951 nt)短得多，因而基于VP4序列的分型方法更便捷和快速。另外，由于VP4处在病毒内部，基因序列较为稳定，所以可能更适用于HEV的分型。

1.2.3基于多段序列分析定型HEV的不同基因区域存在不同突变率，而HEV不同型别之间也可能发生重组[11-13]。已有多篇文献报道了HEV不同型别间存在的重组现象，如Smura等[14]从AFP病例和健康个体的肠道株中发现EV96株其实是HEV C组与脊髓灰质炎病毒的重组产物；Yozwiak等[15]的研究显示，HEV109是HEV A组与C组的重组产物。因此，基于HEV的单一区域进行序列分析而定型的方法并非完全可靠。

为了更准确地对临床分离的HEV株进行分型，Manzara等[16]采用了多片段序列分析定型的方法。除VP1、VP4-VP2序列分析外，他们还加入了5′非编码区序列进行分析，将3段区域序列分析的方法联合使用，成功实现了对其收集的所有HEV标本的分子分型。此外，要得到精确、可信的分型结果，还需对HEV的每一段序列分析建立严格标准。

2 HEV型别的鉴定

2.1 病毒分离和抗血清中和试验

从临床获得的不同类型标本，如鼻咽拭子、粪便、疱疹液、脑脊液等，经处理后接种到细胞系进行病毒分离和培养。常用的细胞系包括人横纹肌肉瘤细胞(RD)、人结直肠腺癌细胞(CaCo-2)、人肺癌细胞(A549)、人喉癌细胞(Hep-2C)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人胎成纤维细胞(HFF)、绿猴肾细胞系(GMK、Vero、LLC)、小鼠转人脊髓灰质炎受体细胞(L20B)[17]、小鼠转CVB受体细胞(L-hCAR)[18]等。产生细胞病变后，用组合血清初步定型，再用特异的单型抗血清证实。目前常用的LBM组合血清(A～H)可鉴别42个型的HEV(包括ECV22、ECV23)。如果未鉴定成功，可再用含19个型的CVA抗体组合(J～P)进行鉴定[19]。另一种组合血清是目前世界卫生组织(World Health Organization，WHO)推荐各国脊髓灰质炎实验室应用的RIVM，在LMB组合血清的基础上还增加了对HEV68～71 型鉴定[20]。国内有中国医学科学院医学生物学研究所配制的KMB组合血清，能鉴定CVA9、CVB、ECV等共28个血清型。

上述传统分型方法一直是业内“金标准”，但存在很多限制。如细胞培养方面的问题包括：①获得多种对HEV敏感的细胞系较困难；②维持多种细胞系生长费用较高；③同时采用多种细胞系进行病毒分离，虽可提高病毒分离率，但工作量大大增加；④一些新发现的病毒不能体外培养，如HEV104[21]，部分CVA只能用接种乳鼠的方法进行分离；⑤细胞培养分离病毒的实验周期长，判断病变存在主观因素，整个过程耗时、耗力。组合血清鉴定方面的问题包括：①HEV血清型繁多，目前可供鉴定使用的抗血清(RIVM、LBM和KMB)尚不足以覆盖全部HEV型别，当抗原变异、出现新的病毒或标本中有多种病毒时，就可能无法鉴定；②某些型别之间有共同抗原而存在交叉反应，会导致结果不可靠[22,23]。

2.2 反转录聚合酶链反应

反转录聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)联合序列测定是目前用于HEV基因分型的常用技术。2003年，Bourlet等[24]采用梯度PCR，区分全部64种不同血清型的HEV。Oberste等[25]针对3′非编码区设计了种特异性RT-PCR引物，可实现HEV A～D组的快速筛查。随后又进一步设计了半套式PCR(semi-nested PCR,snPCR)[26]，可对64种原血清型和22种新血清型的HEV进行分型。

与传统病毒分离和抗血清中和分型方法相比，PCR简便、快速、费用低，适合临床诊断。将PCR产物直接测序，可实现对临床HEV标本进行高灵敏度、高特异度分型。但RT-PCR方法易引起实验室污染，对实验室设施条件和操作人员技术有较高要求。

2.3 核酸杂交和自动化测序

2.3.1核酸杂交根据HEV不同血清型在基因序列上存在高度保守区的特点，20世纪90年代初Rotbart等[27]使用cDNA探针检测多种HEV。这种杂交方法与传统的细胞培养法相比，对脑脊液标本检测的灵敏度和特异度都较差，对粪便标本检测的灵敏度也不高。

相比cDNA探针，RNA探针有更高的亲和性，且无载体序列干扰，避免了非特异性杂交。Rotbart等[28]将3种RNA探针联合使用，可检测16种HEV，而Cova等[29]设计的单RNA探针可检测12种HEV血清型。尽管RNA探针与cDNA探针相比，其检测灵敏度有所提高，但还远远达不到临床诊断的要求[30]。

2.3.2自动化测序桑格双脱氧核苷酸终止法测序是过去测序的主导方法，但因费用高、时间限制等原因，无法普遍应用。新一代的焦磷酸测序技术开创了基因序列测序的新纪元，引发了高通量数据分析的热潮，为临床研究和诊断应用展现了新的前景[31]。代表的商业公司有Roche/454 Life Sciences Ion Torrent、Illumina/Solexa、Applied Biosystems Solid等，以及产品正在开发中的VisiGen和Pacific Biosciences[32]。新型HEV109就借助了新一代测序技术，从尼加拉瓜流行性感冒患者的鼻咽拭子中检测到全长基因序列[15]。

总之，新一代测序技术引入了宏基因组的概念，临床诊断实验室在实现快速筛查临床HEV标本或发现新型HEV的同时，也必将迎来新一轮挑战，包括如何正确处理庞大的数据、合理解释基因突变等问题。

3 展望

HEV型别众多，引起的临床症状多种多样。基于病毒核苷酸序列的基因分型方法越来越多地被应用，为发现新型HEV提供了有效工具，也有利于深入研究HEV基因重组变异和毒力改变等生物学特性。尽管基因分型方法与基于病毒分离和抗血清中和试验的传统分型方法有较高的符合率，但血清分型方法仍是经典的HEV分型方法，基因分型方法不能完全取代。

对HEV的准确分型，不仅可为临床快速诊断和治疗提供依据，还能监测HEV的感染人群和区域，对控制疫情蔓延、开展流行病学调查具有重要意义。

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