碱-乙醇法提取蚕沙中黄酮的工艺研究

孙彩云，李美婷，李虹姣，王哓哓

（河北联合大学 轻工学院，河北 唐山 063000）

碱-乙醇法提取蚕沙中黄酮的工艺研究

孙彩云，李美婷，李虹姣，王哓哓

（河北联合大学 轻工学院，河北 唐山 063000）

以芦丁的提取率为指标，考察了提取时间、提取温度、碱度、乙醇浓度对蚕沙中黄酮提取率的影响，并通过单因素及正交试验确定最佳工艺。结果表明，碱度、乙醇浓度、提取时间、提取温度对蚕沙中总黄酮的提取均有影响；最佳提取工艺为NaOH浓度为3%，乙醇浓度15%，提取时间1.5 h，提取温度70 ℃，蚕沙中黄酮含量约为1.65%。

蚕沙；黄酮；正交试验；提取

黄酮类化合物泛指两个苯环通过中央三碳相互联接而成的一系列化合物，即以C6-C3-C6为基本碳架，是一类在植物界广泛存在的天然活性产物，具有抗菌，抗病毒，抗氧化，抗衰老等多种生物功能[1]。黄酮类化合物因分子中有酚羟基而呈酸性，故可溶于碱性溶液；其羟基糖苷化后一般易溶于热水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂[3]。蚕沙性甘、辛、温，自古入药。蚕沙中含有丰富的黄酮、叶绿素、叶黄素、胡萝卜素、蛋白质、果胶及糖类等多种成分，提取蚕沙中黄酮多以水或稀乙醇为提取剂[1,2]。为有效利用蚕沙中的黄酮，本文采用碱-乙醇做提取剂，对其提取工艺进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂

蚕沙（购买，研细过40目筛备用）；芦丁标准溶液（200 µg·mL-1）：精确称取20 mg芦丁，用60%乙醇溶液微热溶解，并完全转移至100 mL容量瓶中，以60%乙醇溶液稀释至刻度，4°C以下冰箱内保存；乙醇溶液；1 mol·L-1NaOH溶液；10% Al(NO3)3溶液；5% NaNO2溶液。

1.1.2 仪器

722E型分光光度计（上海光谱仪器有限责任公司）；HH-8型恒温数显水浴锅（江苏金坛荣华仪器制造有限公司）；BS124S型电子天平（赛多利斯仪器有限责任公司）。

1.2 方法

1.2.1 黄酮的提取

称取2 g蚕沙，以碱-乙醇做提取剂，料液比1:10，提取2 h后过滤，定容至100 mL容量瓶中。总黄酮的提取率以吸取一定量的提取液经显色后的吸光度来表征。

1.2.2 总黄酮的定量方法

以芦丁为对照标准品（芦丁为黄酮苷，是较常见的黄酮类化合物，具有C6-C3-C6的基本碳架结构），采用NaNO2-Al(NO3)3比色法定量总黄酮。

1.2.2.1 吸收曲线的绘制

准确吸取1 mL芦丁标准溶液于25 mL具塞比色管中，用NaNO2-Al(NO3)3比色法显色后，用1 cm比色皿，以空白试剂作为参比，在480 nm～530 nm范围扫描，分别测定其A值，绘制吸收曲线，确定最大吸收波长。

1.2.2.2 标准曲线的绘制

准确吸取一定量（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL）芦丁标准溶液于25 mL具塞比色管中，用30%乙醇稀释至5 mL，加入5% NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，静置5 min，加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min后加入1 mol·L-1NaOH溶液4 mL，加30%乙醇溶液0.4 mL，摇匀，10 min之后，在最大吸收波长处，用1 cm比色皿，以试剂空白为参比，测定吸光度A值，并绘制标准曲线。

1.2.3 单因素实验

固定其他条件不变，分别考察乙醇浓度、NaOH浓度、提取温度、提取时间对提取效果的影响。

1.2.4 正交实验

因素水平表见表1，采用L9(34)正交表设计实验。

表1 因素水平表

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长及标准曲线

图1为芦丁-NaNO2-Al(NO3)3显色后的吸收曲线。

图1 芦丁-NaNO2-Al(NO3)3显色后吸收曲线

由图1可见，芦丁显色后最大吸收波长在510 nm附近。图2为在510 nm处绘制的A-C标准曲线。

由图2可得标准曲线的回归方程为：

在0～70µg/mL内线性良好。

图2 芦丁标准曲线

2.2 乙醇浓度对黄酮提取效果的影响

固定提取温度、提取时间、料液比、NaOH浓度等条件不变，考察乙醇浓度对提取效果的影响，结果见图3。

老人对呼伦说，我还以为这本书你用不着了。呼伦说那您也不能随便往外借家里的东西啊！老人说可是他参观完你的书房以后硬要借走这本书……说他家里也有几枚老古钱，想对着书看一下能不能挑出几个值钱的。呼伦说您还带别人参观书房？老人挠挠头皮说，不可以吗？呼伦叹一口气，说，那这样吧，明天您再帮我把书要回来……不是我想难为您，妈，如果是别的书也就罢了，可是我还得靠这本书写我的稿子呢。老人想了想，说，可是我不知道他叫什么。

图3 乙醇浓度对提取液吸光度值的影响

由图3可知，随着乙醇浓度逐渐增大，蚕沙总黄酮的提取率逐渐减小，表明蚕沙含有的黄酮结构中极性基团较多，为多羟基黄酮，黄酮结构上的羟基显弱酸性[3]，易溶于极性大的溶液中，但乙醇浓度太低，水溶性杂质会增多。

2.3 NaOH浓度对黄酮提取效果的影响

固定乙醇浓度、提取温度、提取时间、料液比等条件不变，考察NaOH浓度对提取效果的影响，结果见图4。

图4 NaOH浓度对提取液吸光度值的影响

由图4可知，随着加入的NaOH浓度逐渐增大，吸光度值逐渐增加，在2%～5%范围吸光度A比较稳定，在6%以上吸光度显著增大，可能是破坏了黄酮的结构。而小于2%的浓度时，A值显著降低，所以确定适宜的碱度范围为2%～5%。

2.4 不同浓度的NaOH-乙醇液对黄酮提取的影响

固定提取温度、提取时间、料液比等条件不变，考察不同浓度碱-乙醇溶液对黄酮提取效果的影响，结果见表2。

表2 不同浓度的碱-乙醇溶液对吸光度的影响

由表2可知，采用3%NaOH-15%乙醇做提取剂，提取液的A值最大。

固定乙醇浓度、提取时间、料液比、NaOH浓度等条件不变，考察温度对黄酮提取效果的影响，结果见图5。

图5 提取温度对吸光度值的影响

由图5可见，随着提取温度的升高，A值增加，在70℃时最大，80 ℃以后A值略有下降，原因可能是温度超过80 ℃后，由于高于乙醇的沸点，使得溶剂少量挥发；另外，温度太高，碱-乙醇溶剂也可能会破坏提取物的结构，故确定适宜的提取温度为70 ℃。

2.6 提取时间对黄酮提取效果的影响

固定碱-乙醇溶液浓度、提取温度、料液比等条件不变，考察不同提取时间对黄酮提取效果的影响，结果见图6。

图6 提取时间对吸光度值的影响

由图6可见，随着提取时间的增加，A值增加，1.5 h后A值较高且趋于稳定，2.5 h后A值稍有所下降，故确定适宜的提取时间为1.5～2 h。

2.7 正交试验

表3 正交试验结果

由表3正交试验极差分析显示，影响测定芦丁标准溶液的因素主次顺序为：提取时间>乙醇浓度>提取温度>NaOH浓度，最佳条件为：3%NaOH，15%乙醇，提取时间1.5 h，提取温度70 ℃。和单因素实验结果一致。

2.8 验证试验

在正交试验确定的最佳条件下提取两次，合并滤液，并在相同条件下显色，测定其吸光度为0.936，然后根据芦丁标准曲线即可求得蚕沙中黄酮的含量约为1.65%。

3 结论

（1）采用NaNO2-Al(NO3)3法测定蚕沙提取液中芦丁含量，λmax=510 nm，线性回归方程为A=0.011 4C+0.001 8，r=0.999 8，0～70µg/mL线性良好。

（2）采用碱-稀醇作溶剂从蚕沙中提取黄酮，通过单因素实验和正交试验得出了从蚕沙中提取黄酮的最佳提取条件为：3%NaOH，15%乙醇，提取时间1.5 h，提取温度70 ℃。在此条件下进行了验证实验，蚕沙中黄酮的总含量约为1.65%。

[1] 于善凯,沈凤鸣.蚕沙叶绿素提取废渣中黄酮类化合物的提取工艺优化[J].食品研究与开发,2007,28(5):46-48. [2] 李岩亮.蚕沙中黄酮类化合物提取及纯化的研究[J].辽宁丝绸,2006(2):10-12.

[3] 徐任生.天然产物化学[M].北京:科学出版社,2005.

（责任编辑、校对：琚行松）

Extraction of Flavonoids in Silkworm Excrement by Alkali-Ethanol

SUN Cai-yun, LI Mei-ting, LI Hong-jiao, WANG Gai-gai

(College of Light Industry, Hebei United University, Tangshan 063000, China)

The effects of extinction time and temperature, alkalinity, ethanol concentration on the extraction rate of flavones were investigated with Rutosids. The optimum extraction condition of flavone from Silkworm excrement was determined by single factor experiment and orthogonal experiment. The extinction time, temperature, alkalinity, and level of alcohol all affect the extraction of flavone from Silkworm excrement. The best extraction technological conditions was as follows: the extraction time was 1.5 h, the extraction temperature was 70°C, NaOH concentration was 3%, ethanol concentration was 15%, and thus the extraction yield of total flavone was 1.65%.

silkworm excrement; flavonoids; orthogonal experiment; extraction

TQ041

A

1009-9115(2013)02-0007-03

10.3969/j.issn.1009-9115.2013.02.003

2012-12-25

孙彩云（1972-），女，河北遵化人，硕士，讲师，研究方向为天然物质提取。