兔死后角膜厚度与死亡时间的关系

李晓娜，郑吉龙，胡忠国，王保捷

（1.中国医科大学基础医学院，辽宁沈阳 110001；2.中国刑事警察学院法医系，辽宁沈阳 110854；3.吉林省高级人民法院，吉林长春 130033；4.中国医科大学法医学院，辽宁沈阳 110001）

·论著·

兔死后角膜厚度与死亡时间的关系

李晓娜1，郑吉龙2，胡忠国3，王保捷4

（1.中国医科大学基础医学院，辽宁沈阳 110001；2.中国刑事警察学院法医系，辽宁沈阳 110854；3.吉林省高级人民法院，吉林长春 130033；4.中国医科大学法医学院，辽宁沈阳 110001）

目的 研究兔死后角膜厚度变化规律与死亡时间（postmortem interval，PMI）的关系。方法用空气栓塞法建立兔死亡模型。在兔死后0～72h，每隔6h进行角膜取材，切片后常规HE染色，用光学显微镜摄取全角膜图像，结合Motic Images Plus 2.0图像分析软件观察角膜上皮层厚度（x1）、角膜基质层厚度（x2）、全角膜厚度（x3）3项指标的变化值，并作统计学分析，建立与PMI（y）的回归方程。结果在兔死后72h内，角膜基质层厚度和全角膜厚度均在死后12h开始增加，并在死后54h达到高峰，两者与PMI正相关，回归方程分别为y=-0.070 2 x22+11.398x2+1634（R2=0.7122，P＜0.05），y=-0.074 9 x32+12.036 x3+1 819.4（R2= 0.6750，P＜0.05）。结论角膜基质层厚度和全角膜厚度与PMI之间呈较好的线性关系，且角膜基质层厚度优于全角膜厚度，可作为推断死亡时间的指标。

法医病理学；角膜；死亡时间；兔

死亡时间（postmortem interval，PMI）的推断一直是法医学领域最重要且复杂的研究课题之一，在刑事侦查中对犯罪嫌疑人是否具备作案时间的排查、案件性质的判定以及犯罪现场的重建等都具有非常重要的意义。以往法医学者主要根据尸体现象（如尸斑、尸温、尸僵、角膜混浊、膀胱尿量、胃内容物消化程度等）并且结合主观经验来推断PMI，也有学者通过研究免疫组织化学和体液的生化检测[1-2]来推断PMI，但由于受到个体自身因素和外界环境因素在内的诸多因素影响，上述方法的应用均受到了一定限制。眼组织受到眼眶的保护，使其相对隔绝，免受外界环境的影响，因此，眼组织成为法医学者用于推断PMI的重点研究对象。本实验通过观察兔死后72h内角膜厚度的变化规律及其与PMI的关系，从而探索应用角膜厚度进行PMI推断的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康成年大白兔65只，雌雄不限，体质量2.0～2.5kg（中国医科大学实验动物中心提供）。随机分为死后即刻（0 h），死后6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72h组，每组各5只（10眼）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型建立及HE染色

适应性饲养3 d，用空气栓塞法建立兔死亡模型并保持眼睑全部闭合状态。在10～12℃、75%湿度的条件下，分别于上述不同死亡时间进行兔眼角膜取材。用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗兔整个眼球，眼科剪沿角膜缘处环形切开一周，眼科镊小心取下角膜片，用0.9%生理盐水进行清洗，置于10%甲醛溶液内固定48h。制备石蜡切片，并进行HE染色。

1.2.2 成像及图像分析

在光镜下（×100）观察、采集图像，经Motic Images Plus 2.0图像分析软件测量角膜上皮层厚度、角膜基质层厚度、全角膜厚度3项指标（图1）。每组10张切片，每张切片随机观察5个视野，在每个视野下选择最厚和最薄部位，测量后取平均值。

图1 兔角膜观测的3项指标HE×100

1.3 统计学方法

用SPSS 19.0统计学软件对角膜上皮层厚度、角膜基质层厚度和全角膜厚度3项指标随着PMI的延长而变化的规律进行分析，并建立回归分析方程。

2 结果

2.1 兔死后角膜HE染色观察

兔死后12 h角膜上皮层细胞开始轻度水肿，上皮基底细胞核深染，较多基底细胞呈空泡样变性，细胞排列较乱，角膜基质细胞核深染，胶原纤维排列轻微紊乱，角膜基质层厚度明显增加；死后18h角膜上皮细胞水肿明显，上皮基底细胞核深染固缩，绝大多数基底细胞呈空泡样变性，角膜基质细胞亦空泡样变性，胶原纤维排列明显紊乱，出现均质红染的胶质样结构，角膜基质层厚度进一步增加；至死后42h，上述现象进一步加重，角膜内皮细胞易脱落；死后48～72h角膜上皮层部分细胞开始自溶消失，角膜基质细胞数目减少。

2.2 兔死后72h内角膜厚度变化趋势回归分析

兔死后12h角膜基质层厚度与全角膜厚度参数值开始增加，在死后54 h均达到高峰，之后变化缓慢。角膜上皮层厚度随着PMI的延长变化不明显（表1）。兔死后72h内角膜上皮层厚度（x1）、角膜基质层厚度（x2）、全角膜厚度（x3）3项指标随PMI（y）变化的回归方程分别为y=-0.014 5 x12+0.999 1 x1+163.6（R2=0.215 4，P＞0.05），y=-0.070 2 x22+11.398 x2+1 634（R2=0.7122，P＜0.05），y=-0.0749x32+12.036x3+1819.4（R2=0.6750，P＜0.05）。

表1 兔死后72h内角膜厚度各指标测量值

3 讨论

兔角膜与人角膜相比，结构较为相似，仅少了一层前弹力层，故本实验选取兔角膜作为研究对象，采用组织病理学技术制作角膜切片，结合图像分析软件检测角膜厚度随着PMI的延长而发生的变化，以推断早期PMI。本实验条件控制在10～12℃、75%湿度及眼睑全部闭合状态，排除了环境温度及眼睑开闭对角膜厚度的影响。

活体角膜之所以能够始终保持透明和相对脱水状态，是因为在正常活体状态下，角膜内皮细胞膜对物质有主动转运功能，通过细胞膜主动性水转运功能和把房水与角膜隔开的机械性屏障作用，来维持细胞的正常形态和代谢，从而保证了角膜正常厚度和透明度[3]。个体死亡以后，新陈代谢停止，角膜内皮细胞逐渐死亡，其主动性水转运功能和机械性屏障作用下降乃至消失，内皮细胞的渗透性增加，大量的水分进入角膜基质层，角膜基质层的黏多糖含量不变而水分增加，从而导致角膜的厚度增加、透明度下降；在个体死亡后一定时间范围内，时间越长，厚度越大[4-6]。因此认为通过测量角膜不同结构的厚度，可推断PMI。角膜结构变化的研究，早在1723年，Petit等首先应用解剖学方法直接测量了人死后角膜厚度，所测的角膜厚度数值大于正常活体眼角膜用光学方法测量的数值[7]。目前，角膜厚度的测量方法有很多种，能够测量角膜厚度的仪器有A超角膜测厚仪、光学裂隙灯、共焦显微镜、角膜内皮显微镜、超声生物显微镜等。这些方法[8-11]多用于临床活体角膜测量，而测量人死后角膜厚度的方法则极少报道。2001年，孟祥志等[12]通过光学显微镜下目镜测微尺测量角膜厚度，对人死后不同时间的角膜厚度变化与PMI的关系进行了分析，发现随着PMI的延长，角膜厚度增加，且两者呈线性关系。该方法操作简单、便于推广，但通过人为在光学显微镜下用测微尺进行测量产生的误差很大，影响了角膜测量的准确度和精确度。本实验引入了Motic Images Plus 2.0图像分析软件进行图像分析，避免了人为用测微尺测量带来的误差，使测量结果更加准确、可靠。

本实验结果显示，角膜基质层厚度和全角膜厚度均在兔死后12h开始增加，死后54h达到高峰，之后变化缓慢，而角膜上皮层厚度变化与PMI无明显相关关系，提示死后主要是角膜基质层的增厚。分析其原因，可能是个体死后，随着角膜内皮细胞的逐渐失活，内皮细胞渗透性增加使角膜基质层水分增加，引起基质层肿胀。而基质层占角膜厚度的90%，故使角膜增厚伴透明度下降，也从另一方面佐证了死后角膜混浊的原因。同时，角膜上皮层由于本身较薄（本实验测得死亡即刻兔角膜上皮层厚度平均为182.65μm），且位于角膜最外层，易受外界因素影响，所以认为角膜上皮层厚度不适合用于推断早期PMI，而角膜基质层厚度和全角膜厚度变化则适合用于推断PMI。为了排除角膜上皮层厚度的干扰，并且比较角膜基质层厚度、全角膜厚度与PMI的关系，前者相关性更高，因而角膜基质层厚度最适合用于推断PMI。

尽管本实验证实，应用角膜厚度图像分析推断PMI具有一定可行性和客观性，且操作方法简便易行，但本实验方法要提取角膜，对个体外表会造成一定影响，不利于法医实践工作的有效展开。今后若能在无创检验技术方面进一步加以研究，既能保护死者遗容，又能在同一尸体上反复测量不同死亡时间段的角膜厚度，将大大提高测量角膜厚度的精确度。

[1]van den Oever R.Post-mortem vitreous ammonium concentrations in estimating the time of death[J].Z Rechtsmed，1978，80（4）：259-263.

[2]Schoning P，Strafuss AC.Postmortem biochemical changes in canine vitreous humor[J].J Forensic Sci，1980，25（1）：53-59.

[3]Maurice DM.Cellular membrane activity in the corneal endothelium of the intact eye[J].Experientia，1968，24（11）：1094-1095.

[4]Tsunenari S，Kanda M.The roles of corneal mucopolysaccharides and water contents in post-mortem corneal clouding[J].Forensic Sci，1978，11（2）：87-92.

[5]朱志忠.角膜内皮及其临床意义[J].国外医学眼科学分册，1984，8（1）：1-8.

[6]王丽娅，李辰，徐锦堂.角膜内皮细胞活性的检测[J].国外医学眼科学分册，1997，21（3）：184-190.

[7]von Bahr G.Corneal thickness；its measurement and changes[J].Am J Ophthalmol，1956，42（2）：251-266.

[8]李凤鸣.眼科全书[M].北京：人民卫生出版社，1996：842.

[9]李镜海，周芳，周树安，等.正常眼与近视眼多方位角膜厚度研究[J].中华眼科杂志，1994，30（6）：445-448.

[10]朱格非，黄菊天.正常人眼的角膜厚度[J].眼科研究，1995，13（3）：211-213.

[11]张坚，张仲彦，宫枢政.572例（1144只眼）近视眼角膜中央厚度测量[J].中华眼科杂志，1995，31（1）：55-56.

[12]孟祥志，王春，付存菊.死后角膜厚度的实验病理学研究[J].武汉大学学报（医学版），2001，22（1）：35-36.

Relationship between Corneal Thickness and Postmortem Interval in Rabbit

LI Xiao-na1,ZHENG Ji-long2,HU Zhong-guo3,WANG Bao-jie4
（1．College of Basic Medical Science,China Medical University,Shenyang 110001,China;2.Department of Forensic Medicine,China Criminal Police College,Shenyang 110854,China;3.Superior People’s Count of Jilin Province,Changchun 130033,China;4.College of Forensic Medicine,China Medical University, Shenyang 110001,China）

ObjectiveTo explore the relationship between corneal thickness and postmortem interval（PMI）in rabbit.MethodsThe rabbit model was established by air embolism.The rabbit cornea was sampled at 6-hour-interval from 0 to 72 h postmortem.After routine HE staining,the whole cornea image was collected by the optical microscope.Three markers were observed including corneal epithelial thickness（x1）,corneal stromal thickness（x2）and whole corneal thickness（x3）using Motic Images Plus 2.0 image analysis software and the data were statistically analyzed to establish the regression function with PMI（y）.ResultsWithin 72h postmortem,rabbit corneal stromal thickness and whole corneal thickness increased at 12h postmortem and reached the peak at 54h postmortem.The two markers showed positive correlation with PMI.The regression functions of the two markers were y=-0.070 2 x22+11.398 x2+1 634（R2=0.7122,P＜0.05)and y=-0.0749x32+12.036x3+1819.4（R2=0.6750,P＜0.05),respectively.ConclusionThe two markers of corneal stromal thickness and the whole corneal thickness showed the strong linear correlation with PMI.The correlation of the corneal stromal thickness is better than the whole corneal thickness.The two markers can be used to estimate PMI.

forensic pathology;cornea;postmortem interval;rabbits

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.04.001

1004-5619（2013）04-0241-03

2013-03-12）

（本文编辑：刘宁国）

李晓娜（1980—），女，辽宁沈阳人，博士研究生，主要从事血清学研究；E-mail：xiaona830@mail.cmu.edu.cn

王保捷，男，教授，博士研究生导师，主要从事法医物证学教学、科研及鉴定工作；E-mail：bjwang@mail.cmu.edu.cn