慢性间断性低氧对大鼠海马神经元及生长相关蛋白的进行性影响①

陈燕，赵春玲，罗礼容，余广

慢性间断性低氧对大鼠海马神经元及生长相关蛋白的进行性影响①

陈燕1a，赵春玲1a，罗礼容1b，余广1a

目的 观察慢性间断性低氧(CIH)过程中大鼠海马神经元的组织结构及生长相关蛋白(GAP)-43表达的进行性变化。方法成年雄性Sprague-Dawley大鼠40只，随机分为对照组、CIH 1周组、CIH 3周组和CIH 5周组，每组各10只。后三组大鼠在自制缺氧舱内每天缺氧8 h，连续缺氧1周、3周和5周。HE染色后在光学显微镜下观察海马神经元组织结构；免疫组化方法检测海马神经元GAP-43的表达。结果CIH大鼠海马出现变性坏死神经元，并且随着缺氧时间延长，上述改变呈逐渐加重趋势。与对照组比较，CIH组大鼠海马神经元GAP-43阳性表达增多，CIH后1周出现表达高峰(P=0.038)，CIH后3周表达逐渐减少(P=0.382)，CIH后5周表达接近正常水平(P=0.860)。结论随着缺氧时间延长，变性坏死神经元数量呈进行性增多，而GAP-43的表达却与此不一致。

慢性间断性低氧；生长相关蛋白；海马；大鼠

[本文著录格式]陈燕，赵春玲，罗礼容，等.慢性间断性低氧对大鼠海马神经元及生长相关蛋白的进行性影响[J].中国康复理论与实践,2013,19(8):739-742.

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome,OSAHS)是以慢性间断性低氧(chronic intermittent hypoxia,CIH)为发病特征的疾病，对全身各系统都有很大的影响，对神经系统的损害尤为明显，可导致患者出现认知功能障碍。生长相关蛋白(growth associated protein-43,GAP-43)是神经元特异性蛋白，与中枢神经损伤后的再生修复密切相关[1]。目前，在许多研究者制作的各种脑损伤动物模型中都观察到GAP-43表达的变化[2-4]。然而，关于CIH致脑损伤后，这一反映损伤后修复的重要指标有何变化，尚未见相关报道。本实验通过模拟OSAHS发病特征复制CIH大鼠模型，观察CIH过程中大鼠海马神经元组织学结构及GAP-43表达的进行性变化，以探讨这些变化与海马神经损伤修复间的关系，以期为临床OSASH治疗的新途径提供实验性理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

兔抗GAP-43多克隆抗体(Bioworld Technology)，即用型二步法非生物素检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；Nikon ECLIPSE 88i显微摄影系统(尼康，日本)；间歇低氧舱(本实验室设计)由有机玻璃舱、HBO-2B型控氧仪(浙江建德梅城电化分析仪器厂)、氮气储气瓶和排气装置4个部分组成。

1.2 实验动物与分组

健康雄性Sprague-Dawley大鼠40只，体重(250± 20)g，由泸州医学院动物科提供(许可证号：SYXK (川)2004-065)。随机分为对照组、CIH 1周组、CIH 3周组和CIH 5周组，每组各10只。

1.3 动物模型制作

参照薛全福等[5]制作的CIH大鼠模型。将大鼠置于自制的有机玻璃舱内，舱壁留有小缝隙与舱外相通，使舱内气压与大气压平衡。向有机玻璃舱内充入氮气，用数字测氧仪监测舱内氧浓度。每次缺氧开始时氧浓度从23%降至(8%±1%)，用时10 min。缺氧舱内二氧化碳浓度始终＜3%，温度保持(22±2)℃，每天缺氧8 h，分别连续缺氧1、3、5周。缺氧期间大鼠摄食、饮水同常。

1.4 海马组织结构观察

各组大鼠乙醚麻醉后，用生理盐水从左心室至主动脉快速冲洗，约500 ml，4%多聚甲醛快速灌注，开颅取出大脑，在视交叉后缘、大脑脚与桥脑交界处把脑冠状切为3块，置于4%多聚甲醛中后固定4 h以上；将固定好的脑组织进行常规脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。切片(厚度4 μm)，HE染色后光镜下观察海马的组织结构改变。

1.5 海马GAP-43免疫组织化学染色和半定量分析

石蜡连续切片，常规脱蜡至水，对海马进行GAP-43多克隆抗体的免疫组织化学标记，步骤如下。加入3%H2O2室温孵育10 min；抗原微波修复；加入正常山羊血清37℃孵育30 min，甩去多余液；滴加兔抗GAP-43多克隆抗体50 μl(1∶200)，4℃过夜；滴加即用型二步法非生物素检测试剂盒中聚合物辅助剂50 μl(1∶1)；滴加即用型二步法非生物素检测试剂盒中的试剂2；DAB显色5～10 min，细胞胞浆呈棕黄色者为阳性细胞。苏木精轻度复染，脱水、透明、封固。阴性对照用PBS液代替一抗，其余处理相同。GAP-43的标记强度用光密度(optical density,OD)值表示。应用Nikon ECLIPSE 88i显微摄影系统及Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测定海马各区GAP-43的吸光度值。每只动物选3张切片，在海马齿状回、CA1、CA2、CA3和CA4区随机选取3个高倍视野(400×)，分别测定其中阳性染色的OD值，求其平均值，作为该大鼠海马的OD值。同时，测定同一张切片上视束的OD值作为背景，GAP-43的OD值减去背景的OD值得到矫正OD值，即GAP-43免疫反应产物的实际OD值(COD)。用COD值进行比较分析，以避免非特异性染色所造成的误差。

1.6 统计学分析

采用SPSS 13.0统计学软件完成统计处理分析。实验数据采用(±s)表示，各组间比较采用单因素方差分析(One-WayANOVA)，显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 海马神经元组织结构病理改变

对照组海马神经元排列整齐，神经元大小、形态正常，细胞内成分清晰，可见细胞核。CIH各组海马出现不同程度的神经元变性坏死，表现为细胞明显肿胀，胞浆出现空泡，细胞核皱缩，细胞内成分消失，胞体深染。海马CA1～CA4区、齿状回神经元损伤程度不一致，以齿状回神经元损伤程度最重。随着缺氧时间延长，上述改变呈进行性加重趋势，见图1。2.2海马GAP-43免疫组织化学和半定量分析结果

GAP-43免疫反应阳性产物主要定位于海马神经元胞浆中，呈棕黄色颗粒，胞核不着色，经苏木素复染为蓝色。与对照组比较，CIH大鼠海马神经元GAP-43阳性表达增多，CIH后1周出现表达高峰(P= 0.038)，CIH后3周表达逐渐减少(P=0.382)，CIH后5周表达接近正常水平(P=0.860)。见图2、图3。

3 讨论

OSAHS是一种发病率较高的慢性睡眠呼吸疾患，在成年人中的发病率为2%～4%，以男性患者多见，对全身各系统都有很大的影响，对神经系统的损害尤为明显[6-7]。

目前，多数学者认为CIH在OSAHS患者神经系统损害的发生发展起着重要作用。CIH造成循环血中氧分压或氧含量周期性下降和恢复，导致机体多系统尤其是对缺氧敏感的中枢神经系统受损。有研究表明，海马对缺氧具有易感性，海马CA1、CA3区对缺氧尤为敏感，会导致神经元出现不同程度的缺氧性损伤改变。本实验中观察到，与对照组比较，CIH各组海马出现变性、坏死神经元，并且随着缺氧时间延长，变性坏死神经元数量呈进行性增多趋势。此外，CIH各时间组间也存在显著差异，说明缺氧不仅使海马神经元结构遭受破坏，神经元变性坏死，而且这种病理性损伤随着缺氧的进行呈慢性进行性加重趋势。

图1 CIH对海马齿状回神经元组织学变化的影响(HE染色，400×)

图2 CIH对海马齿状回神经元GAP-43阳性表达的影响(免疫组化染色，400×)

图3 CIH对海马神经元GAP-43阳性表达的COD值的影响

GAP-43是神经元特异性蛋白，主要存在于分化定性并开始轴突生长的神经元中，在脑功能活跃区(如大脑皮质、海马)表达量很高。有研究表明，在神经系统的初期发育阶段中，GAP-43在神经元胞浆中的含量较高；随着脑的发育成熟，GAP-43的表达逐渐降低；当出现脑损伤时，其表达又会增高[8-11]。因而将GAP-43视为研究神经生长发育和损伤修复的重要标记物之一[12-13]。

本实验中观察到，CIH过程中大鼠海马GAP-43的表达出现进行性变化。CIH导致大鼠海马GAP-43阳性表达增强，表达高峰出现在CIH后1周，随后表达逐渐减少直到接近正常水平。这一结果提示，缺氧性脑损伤后，神经系统启动保护机制并修复受损的神经元，通过GAP-43的不断增加促进突触的不断生长是神经进行修复的重要方式之一。关于CIH过程中大鼠脑中GAP-43进行性变化的原因，研究者认为缺氧初期，缺氧损伤刺激了未受损神经元的代偿机制，使其合成GAP-43增加，但随着缺氧的进行，导致海马神经元损伤加重，抑制海马神经元GAP-43的合成，因而GAP-43的表达逐渐降低。但也有学者认为，脑损伤后GAP-43增高可能与神经细胞死亡后释放GAP-43有关[9]。但在本实验中观察到，CIH大鼠海马神经元随着缺氧时间延长，海马神经元病理损伤逐渐加重，变性坏死神经元数量呈进行性增多趋势，似乎海马GAP-43的表达也应该呈进行性增加趋势而不是在出现表达高峰后逐渐降低到正常。GAP-43的调节是一个十分复杂的过程，受多种因素的影响，至于本研究中CIH大鼠脑中GAP-43增高的原因及详细机制还有待进一步研究。

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Progressive Effects of Chronic Intermittent Hypoxia on Hippocampus Neuron and Growth Associated Protein-43 in Rats

CHEN Yan,ZHAO Chun-ling,LUO Li-rong,et al.Department of Physiology,Center of Functional Experiment,Luzhou Medical College,Luzhou 646000,Sichuan,China

ObjectiveTo explore the effect of chronic intermittent hypoxia(CIH)on hippocampus neuron and growth associated protein-43(GAP-43)in rats.Methods40 adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group,CIH 1 week group,CIH 3 weeks group and CIH 5 weeks group with 10 rats in each group.The CIH groups were exposed to intermittent hypoxia in designed cabin 8 h every day for 1 week,3 weeks and 5 weeks.The pathological changes of hippocampal neurons were observed by HE staining.The GAP-43 expression of hippocampus was detected by immunohistochemical staining.ResultsThere was degeneration and necrosis of hippocampal neurons in the CIH rats,and it became worse gradually along with the hypoxia.Compared with the control group,the GAP-43 expression in hippocampus increased in CIH rats.The peak of GAP-43 expression appeared in the 1st week(P=0.038)and then it decreased in the 3rd week(P=0.382)and it was closed to the normal level in the 5th week(P=0.860).ConclusionDegeneration and necrosis of hippocampal neurons exacerbated gradually along with the hypoxia,while GAP-43 expression changed inconsistently.

chronic intermittent hypoxia;growth associated protein;hippocampus;rats

R541.6

A

1006-9771(2013)08-0739-04

2013-01-23

2013-03-06)

1.泸州医学院，a.生理学教研室；b.机能实验中心，四川泸州市646000。作者简介：陈燕(1979-)，女，汉族，四川隆昌县人，硕士，讲师，主要研究方向：缺氧性脑损伤的发病机制和防治。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.08.007