丁基苯酞对弥漫性脑创伤大鼠运动功能及学习记忆能力的影响①

李建民，赵雅宁，薛承景，陈长香，李淑杏

·基础研究·

丁基苯酞对弥漫性脑创伤大鼠运动功能及学习记忆能力的影响①

李建民，赵雅宁，薛承景，陈长香，李淑杏

目的 研究丁基苯酞对弥漫性脑创伤大鼠运动功能及学习记忆能力的影响。方法128只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、创伤组、丁基苯酞低剂量组和丁基苯酞高剂量组，每组各32只。假手术组不致伤，丁基苯酞低、高剂量组分别注射丁基苯酞80 mg/kg和160 mg/kg，每24小时注射1次。采用Marmarou法建立大鼠弥漫性颅脑损伤模型。术后24 h、48 h、72 h取大脑皮层冠状缝左右0.2 cm组织，光镜和电镜下观察脑组织超微结构变化，对大鼠综合运动能力以及学习记忆功能进行评测。结果与创伤组比较，丁基苯酞低、高剂量组大鼠脑组织超微结构，包括神经元内细胞器、轴索及毛细血管等超微结构的损伤程度减轻，计数存活神经元密度明显增加(P＜0.01)；大鼠逃避潜伏期时间明显缩短(P＜0.01)，72 h亚组穿越平台次数明显增多(P＜0.01)；综合运动能力评分提高(P＜0.05)。上述指标变化在高剂量组更为显著。结论丁基苯酞可改善弥漫性脑创伤后运动和学习记忆能力损伤，其机制与减少神经元丢失，减轻脑组织超微结构损害有关。

弥漫性脑创伤；学习；运动；超微结构；大鼠

[本文著录格式]李建民，赵雅宁，薛承景，等.丁基苯酞对弥漫性脑创伤大鼠运动功能及学习记忆能力的影响[J].中国康复理论与实践,2013,19(8):729-733.

弥漫性脑创伤(diffuse brain injury,DBI)是神经外科临床常见疾病，由于大多数DBI患者不适合手术治疗，因此临床上神经保护剂的应用尤为重要。丁基苯酞(3-n-butylphthalide,NBP)是从芹菜籽中分离出来的我国开发的一个新型抗脑缺血药物，现已证实丁基苯酞能够有效抑制急性脑缺血性损伤的多个病理环节，如改善缺血缺氧脑组织的能量代谢、保护线粒体功能、抑制β-淀粉样肽、氧自由基和炎症物质释放或堆积等多种作用、减少细胞缺血性凋亡、降低局灶性脑缺血大鼠的脑梗死面积等[1-5]。但目前丁基苯酞在脑创伤的应用方面尚处在初步探索阶段。本研究应用Marmarou[6]等的大鼠DBI模型，从超微结构角度探讨丁基苯酞对DBI后神经功能的影响，为其在临床广泛应用提供形态学理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物分组和模型制备

128 只雄性Sprague-Dawley大鼠采用随机数字表法分为假手术组(n=32)、创伤组(n=32)、丁基苯酞低剂量组(低剂量组，n=32)和丁基苯酞高剂量组(高剂量组，n=32)。每组又分为24 h、48 h和72 h 3个亚组。

创伤组动物参照Marmarou法[6]制作大鼠DBI模型：乙醚麻醉动物70～150 s，重450 g、直径18 mm的铜棒自1.5 m高度垂直落下撞击置于大鼠冠状缝与矢状缝正中的不锈钢垫，造成大鼠弥漫性颅脑创伤模型。假手术组只进行乙醚麻醉而不致伤。丁基苯酞由石药集团恩必普药业有限公司提供，用前用0.5%Tween-80制成乳剂。低剂量组和高剂量组分别在伤后腹腔注射丁基苯酞80 mg/kg、160 mg/kg，每24小时注射1次，连续72 h。模型制作过程中创伤组死亡18只，低剂量组死亡17只，高剂量组死亡17只，均予补齐。

1.2 脑组织形态结构观察

光镜：假手术组各时间点取3只，其余各组取4只。0.4%戊巴比妥纳麻醉动物，开胸、暴露心脏，4%多聚甲醛行心脏灌流，断头取脑，在视交叉后1 mm和6 mm处冠状面切开，取中间块入4%多聚甲醛固定液固定，石蜡包埋，切片(片厚5 μm)，进行HE染色。在有测微尺的光学显微镜(400×)下观察皮质区神经元形态变化并计神经细胞数，即神经元密度(neuronal density,ND)，取均值。

电镜：假手术组各时间点取1只，其余组伤后各时间取2只。迅速断头取脑，冰台上分离大脑皮质，取大脑冠状缝左右0.2 cm组织，切成1×1×1 mm组织块，立即以4%戊二醛固定，0.1 mol/L二甲砷酸缓冲液冲洗两遍，1%四氧化锇固定，再经缓冲液冲洗，逐级丙酮脱水，环氧树脂浸透，包埋，超薄切片，醋酸铀枸橼酸铅染色。透射电镜(H-7650，日本)观察脑组织超微结构的变化。

1.3 运动功能检测评分

假手术组各时间点取3只，其余组伤后各时间取4只。应用转棒仪检测大鼠左右肢体的协调能力、平衡能力、体力和耐力等综合能力。主要方法：记录大鼠在加速转动、最高转数为100 r/min的情况下，大鼠掉落的时间，共测定3次，每次间隔至少15 min。分值越低，神经功能损伤越重。

1.4 学习记忆测定

假手术组各时间点取3只，其余组伤后各时间取4只。按照Smith等[7]的方法，采用Morris水迷宫进行检测。每只动物晨起训练5次后分别在上午、下午各测试6次，记录各组大鼠逃避潜伏期时间(s)，取检测记录的总均值。

1.5 统计学分析

应用SPSS 17.0对实验数据进行统计分析，数据结果以(±s)表示，进行单因素方差分析，显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 脑组织形态结构变化

2.1.1 光镜 假手术组皮质区神经元结构完整，排列整齐致密，未见变性坏死的神经元。与假手术组比较，创伤组中皮质区神经元大部分变性坏死，细胞间隙加大，细胞核浓缩、深染，溶解、消失，存活神经元密度显著下降(P＜0.001)。与创伤组比较，低剂量组皮质区大部分神经元结构完整，存活的神经元密度明显增加(P＜0.01)；与低剂量组比较，高剂量组存活神经元明显增加(P＜0.01)。见图1、表1。

2.1.2 电镜

假手术组：神经元内可见正常细胞器，包括高尔基体、粗面内质网、多聚核糖体、线粒体、溶酶体等，神经细胞轴索结构排列正常、微丝微管正常，血管内皮细胞结构正常。

创伤组：神经细胞不同程度固缩，胞质、胞核电子密度增高，核膜凹陷，高尔基体扩张呈大泡状，多聚核糖体解聚，高度肿胀、线粒体嵴断裂或空泡化，双膜结构模糊或外膜破裂、消失，细胞器稀疏。轴索排列紊乱、肿胀，髓鞘泡鼓、内折及分层，轴索变性、断裂等。

低剂量组：神经细胞可见少量的固缩，多聚核糖体解聚，可见少量肿胀，神经元的粗面内质网、多聚核糖体、线粒体损伤较轻，神经元及毛细血管结构损伤减轻。

高剂量组：神经元的粗面内质网、多聚核糖体、线粒体基本正常，轴突内微管、微丝保存良好，神经元及毛细血管结构损伤明显减轻。见图2、图3。

2.2 综合运动能力评分

创伤组大鼠的局部感觉障碍，大多表现为面部、胡须、耳后皮肤触觉的损伤，四肢的肌力下降，双后肢伸直不对称，用手提起尾巴令其前行，向一侧倾斜，甚至向一侧原地转圈。同时攀爬能力、平衡能力和本体感觉能力均下降，体力与耐受力受损，大鼠精神状态不佳，食欲下降，难进食水。创伤组综合运动能力评分显著低于假手术组(P＜0.001)；与创伤组比较，低剂量组面部、胡须、耳后皮肤触觉的损伤减轻，用手提起尾巴令其前行，仅向一侧倾斜，攀爬能力、平衡能力和本体感觉能力下降不明显，综合运动能力评分高于创伤组(P＜0.05)。高剂量组面部、胡须、耳后皮肤触觉损伤明显减轻，四肢的肌力下降不明显，双后肢伸直对称，用手提起尾巴令其前行，向一侧轻微倾斜，攀爬能力、平衡能力和本体感觉能力均微下降，综合运动能力评分高于低剂量组(P＜0.05)。见表2。

2.3 学习记忆评价

与假手术组比较，创伤组大鼠逃避潜伏期时间显著延长，穿越原平台位置的次数显著减少(P＜0.001)；与创伤组比较，低剂量组大鼠逃避潜伏期时间明显缩短(P＜0.01)，72 h亚组穿越原平台位置的次数明显增多(P＜0.01)；与低剂量组比较，高剂量组大鼠逃避潜伏期时间缩短(P＜0.05)，48 h、72 h亚组穿越平台次数明显增多(P＜0.01)。见表3、表4。

图1 各组皮质神经细胞形态的变化(HE染色，400×)

图2 皮质脑组织神经元超微结构(电镜，20,000×)

图3 皮质脑组织内皮细胞超微结构(电镜，20,000×)

表1 各组大鼠皮质区存活神经元密度比较(/μm2)

表2 各组大鼠综合运动能力评分比较

表3 各组大鼠逃避潜伏期的比较(s)

表4 各组大鼠穿台次数比较

3 讨论

脑创伤可造成神经细胞丢失，而神经细胞丢失带来的直接后果是神经功能的缺失。有研究认为，颅脑损伤后神经功能的恢复很大程度依赖治疗窗内恢复或存在神经元的存活。如姚声涛等发现依达拉奉可抑制Marmarou脑创伤模型中氧自由基-线粒体信号通路激活，降低神经细胞凋亡而起到脑保护作用[8]。涂悦等发现亚低温治疗可降低颅脑创伤后β淀粉样蛋白基因和蛋白表达，减少颅脑创伤导致的神经细胞死亡[9]。丁基苯酞是从芹菜籽中提取出来的左旋体，后经人工合成为消旋体，其药理作用涉及脑缺血的多个环节，重构缺血区循环，改善缺血脑缺脑组织的能量代谢、保护线粒体功能、抑制花生四烯酸、氧自由基等物质释放等多种作用[1-5]。本实验结果说明，丁基苯酞可以改善颅脑创伤造成的神经功能缺陷，减少神经细胞的丢失，且疗效与用药的剂量有关。近期有学者证实丁基苯酞可减弱Caspase-8活化、抑制促凋亡蛋白Smac表达，增强Bcl-2表达，从而减少缺血后神经细胞凋亡和死亡[10-11]。

水迷宫测试是检测动物认知功能的经典方法，其中逃避潜伏期反映大鼠通过对空间标志物的比较和评价来寻找平台位置的能力，即获取有效学习能力，而检测穿越原平台位置次数反映记忆的保持能力。本研究结果显示，丁基苯酞可改善脑创伤造成的动物学习记忆能力损伤。吴娟等对31例中度血管性痴呆患者应用丁基苯酞治疗，8周后患者记忆力、计算力、语言运用及视空间能力均有明显提高，继续用药12周上述症状改善更为显著，该学者认为丁基苯酞改善认知的作用与提高脑细胞能量代谢水平、抗氧化应激有关[12]。皮质是脑内与学习和记忆密切相关的部位，动物实验表明，与生活环境简单的大鼠比较，生活在复杂环境的大鼠学习记忆活动增多，其大脑皮层发达，突触联系增多[13]。临床研究显示，额叶皮质损伤的患者在学习、记忆以及多种认知加工过程中出现障碍[14]。本研究结果显示，丁基苯酞可以明显减轻动物大脑皮质超微结构损害程度、抑制皮质区神经细胞丢失，是丁基苯酞改善创伤动物学习记忆能力的机制之一。

总之，本研究从脑创伤后脑组织超微结构角度阐述丁基苯酞的神经保护作用，为丁基苯酞治疗颅脑创伤后的神经功能和学习记忆能力恢复提供药理学基础。

[1]Zhang Y,Fu QX,Liu ZF,et al.Effects of butylphthalide preconditioning on expression of neuroglobin and the activity of mitochondrium Na+,K+-ATPase in cerebral ischemia of gerbils[J]. J Chinese Clin Med,2007,2(4):215-219.

[2]张培蕾,鲁海涛,朱悦奇,等.丁苯酞对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].介入放射学杂志,2012,21(3): 239-240.

[3]Rodrigo J,Fernandez AP,Serrano J,et al.The role of free radicals in cerebral hypoxia and ischemia[J].Free Radic Biol Med,2005,39(1):26-50.

[4]Xiong J,Feng YP.The protective effect of butylphthalide against mitochondrial injury during cerebral ischemia[J].Acta Pharm Sin,2000,35:408-412.

[5]Zhang T,Yan W,Li Q.3-n-Butylphthalide(NBP)attenuated neuronal autophagy and amyloid-β expression in diabetic mice subjected to brain ischemia[J].Neurol Res,2011,33(4): 396-404.

[6]Marmarou A,Foda MA,van den Brink W,et al.A new model of difuse brain injury in rats Part I:pathophysiology and biomechanics[J].Neurosurg,1994,80(2):291-300.

[7]Smith DH,Okiyama K,Thomas MJ,et al.Evaluation of memory dysfunction following experimental brain injury using the Morris water maze[J].J Neurotrauma,1991,8(4):259-269.

[8]姚声涛,唐文渊,陈佳林,等.氧自由基-线粒体信号通路在Edaravone治疗创伤性脑创伤中的作用[J].中华创伤杂志,2008, 5(12):990-994.

[9]涂悦,程世翔,孙洪涛,等.亚低温治疗对颅脑创伤后β淀粉样蛋白表达影响的实验研究[J].中华神经外科杂志,2012,28(2): 166-170.

[10]焦东亮,倪秀山,高艳,等.丁苯酞对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后Caspase-3表达的影响[J].中国临床神经科学,2007, 15(1):19-23.

[11]董莎,刘瑞珍,李晓东,等.丁苯酞对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后促凋亡蛋白表达的影响[J].中西医结合脑血管病杂志,2010,8(5):578-579.

[12]吴娟,付朝晖,杨晋,等.丁苯酞对血管性痴呆患者认知功能的改善作用[J].重庆医学,2012,41(6):571-574.

[13]杨敏,李涛,余茜.运动训练对脑梗死大鼠行为学及突触形态结构参数的影响[J].中国康复医学杂志,2007,22(1):24-27.

[14]赵雅宁,李建民,陈长香,等.颅脑损伤患者恢复期执行功能障碍状况的调查分析[J].中华护理杂志,2010,45(3):254-257.

Effects of 3-n-Butylphthalide on Neuromotor Function and Learning-Memory Function after Severe Diffuse Brain Injury in Rats

LI Jian-min,ZHAO Ya-ning,XUE Cheng-jing,et al.Department of Rehabilitation College,Hebei United University,Tangshan 063000,Hebei,China

ObjectiveTo study the effects of 3-n-butylphthalide(NBP)on motor function and learning and memory ability in rats with diffuse brain injury(DBI).Methods128 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group,traumatic group, low-dose NBP treatment group and high-dose NBP treatment group with 32 rats in each group.Every group was divided into 24 h,48 h and 72 h subgroups.DBI rat model was established according to the description of Marmarou's diffused brain injury.The histopathologic changes of cerebral tissue(0.2 cm bilateralis coronal line)were observed by light and electron microscope at 24 h,48 h and 72 h after injury.Morris water maze and rolling test were performed daily at 24,48 and 72 h(time points).ResultsCompared with the model group,the damage of brain tissue decreased,and the survival nerve cells increased(P＜0.01).The behavioral tests showed that the latency to find the platform shortened(P＜0.01)and the frequency of crossing the platform increased in the 72 h subgroup(P＜0.01).The general movement ability enhanced in NBP groups(P＜0.05).All the indexes were more significant in high-dose NBP treatment group.ConclusionNBP can improve neurological function and learning and memory function after brain injury and the molecular mechanisms is related to the decrease of the nerve cells lose and traumatic cerebral ultrastructure damage.

diffuse brain injury;learning;motor;ultrastructure;rats

R651.1

A

1006-9771(2013)08-0729-05

2012-08-23

2013-06-12)

1.河北省科技厅支撑课题(No.20276102D)；2.河北省教育厅重点课题(No.ZD2010106)。

河北联合大学康复医学院，河北唐山市063000。作者简介：李建民(1962-)，男，汉族，河北唐山市人，博士，教授，主要研究方向：脑创伤基础研究。通讯作者：赵雅宁。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.08.005