HPLC测定2,5’-二溴-4,5,2’-三羟基二苯甲酮原料药的含量及有关物质

李勇，冯秀娥，梁泰刚，李青山

(山西医科大学药学院，太原 030001)

HPLC测定2,5’-二溴-4,5,2’-三羟基二苯甲酮原料药的含量及有关物质

李勇，冯秀娥，梁泰刚，李青山*

(山西医科大学药学院，太原 030001)

目的 建立HPLC测定海洋来源活性化合物2,5’-二溴-4,5,2’-三羟基二苯甲酮原料药(LM49)的含量及有关物质的方法。方法 采用Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，甲醇-乙腈-水(磷酸调pH至3.0)(70∶10∶20)为流动相，检测波长为261 nm，流速0.8 mL·min-1，柱温25 ℃。结果 主峰能与杂质峰达到良好分离，LM49在浓度1.0～100 mg·L-1内线性关系良好(r=0.999 9)，最低检测限为0.02 mg·L-1，平均回收率为99.8%(RSD=0.88%)。结论 本法简便、快速、准确，可用于LM49原料药的含量及有关物质的测定。

高效液相色谱法；2,5’-二溴-4,5,2’-三羟基二苯甲酮；有关物质；含量测定

2,5’-二溴-4,5,2’-三羟基二苯甲酮(LM49)为课题组自主合成、具有全新结构的海洋来源溴酚化合物，其对过氧化氢损伤的人脐静脉内皮细胞有显著的保护作用[1]，提示该化合物对心脑血管疾病有较强的应用开发前景。由于LM49为本课题组自主合成，目前还没有建立含量测定和有关物质的检测方法。原料药的质量标准建立与质量控制是其后续系统研发工作的基础，为使LM49的质量可控并为后续研究提供质量稳定的样品，本实验采用HPLC对LM49原料药的含量及有关物质的检查进行了研究，结果表明，所建立的方法准确、专属性强、灵敏度高、分离度好，可有效检测原料药中LM49的含量并对有关物质进行控制。

1 仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；BT25S型电子天平(德国Sartorius)；LM49对照品(以邻甲氧基苯甲酰氯与1,2-二甲氧基苯为起始原料自制，经3次重结晶，面积归一化法测定其纯度≥99.85%)；LM49供试品(自制，批号：20120302，20120511，20120723)；甲醇、乙腈为色谱纯；超纯水(用磷酸调节pH至3.0)，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：甲醇-乙腈-水(70∶10∶20)(水用磷酸调pH至3.0)，流速0.8 mL·min-1，检测波长261 nm，柱温25 ℃，进样量20 μL。

2.2 对照品溶液和供试品溶液的配制

取室温下减压干燥至恒重的LM49对照品和LM49供试品(批号：20120511)各约5 mg，精密称定，分别置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得100 mg·L-1的对照品贮备液和供试品贮备液，置于4 ℃冰箱中保存。

2.3 检测波长的确定

精密量取5.0 mL对照品贮备液，用甲醇稀释并定容至10 mL，配制成50 mg·L-1的溶液，进行DAD检测，结果表明，在261 nm处有最大吸收，确定261 nm为检测波长。

2.4 系统适用性试验

按“2.1”项下色谱条件进样测定，LM49的保留时间为7.48 min，理论板数按LM49计算不低于8 000，与相邻杂质的分离度＞1.5，分离良好，峰形对称，结果见图1。

图1 系统适用性试验相关HPLC色谱图A-LM49对照品溶液；B-LM49供试品溶液；C-LM49对照品/原料/中间体混合溶液；1-LM49；3,4-原料；2-原料中的杂质；5,6-中间体Fig 1 HPLC chromatograms of system suitability of LM49 A-LM49 reference substance; B-LM49 test sample; C-LM49/raw materials/intermediates; 1-LM49; 3,4-raw materials; 2-impurity of raw material; 5,6-intermediates

2.5 线性关系和方法学研究

2.5.1 线性关系 分别精密量取对照品贮备液适量，用甲醇稀释成浓度为1.0，5.0，25，50，75，100 mg·L-1的溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以浓度(C)为横坐标，色谱峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归，回归方程为：A=37.546C-27.8，r=0.999 9。结果表明，本品在1.0～100 mg·L-1内线性关系良好。

2.5.2 检测限及定量限 精密量取对照品贮备液适量，逐级稀释，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录信噪比(S/N)为3，10的色谱图。结果LM49的最低检测浓度为0.02 mg·L-1，最低检测限为0.4 ng；最低定量浓度为0.05 mg·L-1，最低定量限为1 ng。

2.5.3 精密度 精密量取对照品贮备液适量，用甲醇稀释至浓度为50 mg·L-1的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，1 d内连续进样6次，考察日内精密度，RSD为0.67%；取上述溶液，每天进样1次，连续测定5 d，考察日间精密度，RSD为1.08%。表明精密度良好。

2.5.4 重复性 取同一批供试品(批号：20120511) 2.5 mg，共5份，精密称定，置于50 mL量瓶中，分别用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。按“2.1”项下色谱条件，按含量测定方法测定，结果其平均含量为99.26%，RSD为0.51%，表明方法重复性良好。

2.5.5 稳定性 取浓度为50 mg·L-1(批号：20120511)的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，分别测定其在室温下放置0，2，4，8，12，24 h及3 d后的峰面积，以峰面积考察溶液的稳定性，RSD为1.46%，结果表明，室温放置3 d的供试品溶液稳定性良好。

2.5.6 回收率 称取减压干燥至恒重的同一批供试品(批号：20120511)5.07 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL量瓶中。精密量取供试品溶液1.0 mL于10 mL量瓶中，共9份。分别加入对照品溶液(100 mg·L-1)各0.6，1.0，1.4 mL，各3份，加甲醇稀释至刻度，定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算平均回收率，结果见表1。

2.6 含量测定

取本品3批，用甲醇配制成质量浓度为100 mg·L-1的供试品液，另精密称取LM49对照品5.0 mg，置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为100 mg·L-1的对照品液，分别精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算含量[2]。结果批号为20120302，20120511，20120723的样品含量分别为100.1%，99.3%，100.4%，RSD分别为0.56%，0.62%，0.44%。

表1 LM49的回收率测定(n=9)Tab 1 The recovery determination of LM49 (n=9)

2.7 专属性试验

为考察HPLC的专属性，根据合成工艺、化合物结构特点及贮存条件，对LM49进行了酸、碱、氧化、高温、强光照射等加速破坏实验[3-6]。取LM49供试品(批号：20120511)适量，用甲醇制成100 mg·L-1的溶液，取样2 mL，共5份。其中1份加2 mL 0.1 mol·L-1的盐酸溶液，加热回流2 h，冷却至室温，用0.1 mol·L-1的氢氧化钠溶液中和至中性；1份加2 mL 0.1 mol·L-1的氢氧化钠溶液，加热回流2 h，冷却至室温，用0.1 mol·L-1的盐酸中和至中性。其中1份加30%过氧化氢溶液0.5 mL，加热回流1 h，冷却至室温。1份80 ℃加热回流1 h。另外1份置于4 500 Lx照度下放置72 h。按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果见图2。由加速破坏性实验结果可知，所建HPLC方法能有效检测出各破坏性实验产生的降解产物，且降解产物均能与主峰达到良好分离，表明对有关物质检查的专属性良好。

2.8 有关物质的检查

精密称取LM49样品5.0 mg于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为供试溶液，精密量取供试溶液1.0 mL，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照液。精密量取对照液20 μL，注入液相色谱仪，调节检测器的灵敏度，使主成分的色谱峰高约为满量程的30%。再精密量取供试溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图至对照品主峰保留时间的2.5倍。量取供试溶液色谱图中各杂质峰的峰面积总和，用主成分自身对照法计算有关物质的量。结果3批样品的有关物质含量分别为0.34%，0.45%和0.48%。

3 讨论

LM49易溶于甲醇，因此选用不同配比的甲醇-水组成流动相，由于LM49含有酚羟基，呈弱酸性，考察了不同pH值对化合物色谱行为的影响，最终发现用磷酸调节水相的pH为3.0时，色谱峰形及分离度均较好，化合物保留时间适中。流动相中加入乙腈，使色谱峰的对称性得到了进一步优化，最终确定流动相的配比为甲醇-乙腈-水(70∶10∶20)(水用磷酸调节pH至3.0)。

本实验为LM49建立了简便、快速、准确、专属的HPLC方法，为其质量控制及有关物质检查提供了可靠的依据。

REFERENCES

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Determination of 2,5’-Dibromo-4,5,2’-trihydroxydiphenylmethanone and Its Related Substances by HPLC

LI Yong, FENG Xiu’e, LIANG Taigang, LI Qingshan*(School of Pharmaceutical Sciences, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

OBJECTIVE To establish an HPLC method for the determination of 2,5’-dibromo-4,5,2’-trihydroxydiphenylmethanone(LM49) and its related substances. METHODS HPLC method was carried on a column of Diamonsil C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) with the mobile phase of methanol-acetonitrile-water (adjusted to pH 3.0 with phosphoric acid) (70∶10∶20) at the flow rate of 0.8 mL·min-1and the detection wavelength was set at 261 nm. The column temperature was 25 . ℃RESULTS LM49 was completely separated from the impurities. A good linearity(r=0.999 9) of LM49 was obtained at the concentration range of 1.0-100 mg·L-1. The minimal detection limit was 0.02 mg·L-1. The average recovery of method was 99.8%(RSD=0.88%). CONCLUSION The analytical method is simple, rapid, sensitive and accurate for the determination of LM49 and its related substances.

HPLC; 2,5’-dibromo-4,5,2’-trihydroxydiphenylmethanone; related substances; content determination

R917.101

B

1007-7693(2013)10-1104-04

2012-12-21

国家“863”计划项目(2013AA092903)；山西省自然科学基金(2013011060-2)；山西医科大学科技创新基金(01201116)；山西医科大学博士启动基金(B03201213)

李勇，男，硕士 Tel: 15903460874 E-mail: yong5130@126.com*

李青山，男，博士，博导 Tel: (0351)4690322 E-mail: sxlqs2012@163.com