丹参酮对兔急性心梗再灌注损伤的心肌保护

章慧慧，黄抒伟，王琳莉，林冬铭

(1.杭州市余杭区第一人民医院，杭州 311100；2.浙江中医药大学附属第二医院心内科，杭州 310005)

丹参酮对兔急性心梗再灌注损伤的心肌保护

章慧慧1,2，黄抒伟2*，王琳莉2，林冬铭2

(1.杭州市余杭区第一人民医院，杭州 311100；2.浙江中医药大学附属第二医院心内科，杭州 310005)

目的 探讨丹参酮在心肌梗死再灌注损伤中的干预作用，为临床治疗提供实验依据。方法 将40只，♂，新西兰大白兔按成组设计应用随机列表法分成4组，每组10只：葡萄糖再灌注组、丹参酮再灌注治疗组、丹参酮冠脉结扎前治疗组和假手术组。建立再灌注模型后经耳缘静脉给药。分别于结扎前5 min、结扎后1 h、再灌注后2 h时，取血清检测肌酸激酶(CK)、肌酸激酶的同功酶(CK-MB)、肌钙蛋白Ⅰ(Tn-Ⅰ)。并于再灌注后2 h，以1%的四氮唑红溶液制作心肌切片，以AutoCAD 2002图形设计软件计算坏死心肌范围。结果 ①丹参酮再灌注组与葡萄糖再灌注组、丹参酮结扎前治疗组与葡萄糖再灌注组在再灌注后2 h的CK、CK-MB、Tn-Ⅰ有统计学差异(P＜0.05)；丹参酮再灌注组与丹参酮结扎前治疗组在再灌注后2 h的CK、CK-MB无统计学差异(P＞0.05)、Tn-Ⅰ有统计学差异(P＜0.05)。②丹参酮再灌注组与葡萄糖再灌注组、丹参酮结扎前治疗组与葡萄糖再灌注组心肌梗死范围比较有统计学差异(P＜0.05)。丹参酮再灌注组与丹参酮结扎前治疗组无统计学差异(P＞0.05)。结论 静脉注射丹参酮可以降低兔急性心肌梗死再灌注后CK、CK-MB、Tn-Ⅰ，并减少兔急性心肌梗死面积。

丹参酮；心肌缺血再灌注损伤；心肌保护

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury)是指在心肌缺血一段时间后，再次恢复血供后发生的更为严重的损伤，可以导致缺血面积扩大、无复流(no-reflow phenomenon，NR)、心肌顿抑和再灌注心律失常等。目前，心肌缺血再灌注损伤越来越受到人们重视，对于心肌缺血再灌注损伤的发生机制还没有完全清楚。丹参酮作为我国的传统中药，在治疗心脑血管病方面有着很好的效果，已有多项研究显示丹参酮具有抗炎、抗血小板、抗血栓形成、缓解心绞痛以及抗肿瘤作用。本实验以新西兰大白兔为实验对象，通过结扎冠脉建立急性心肌梗塞(acute myocardial infarction，AMI)再灌注模型，评价AMI再灌注后心肌梗死面积以及血液学指标的变化，探讨丹参酮对缺血再灌注损伤的保护作用及其作用机制，为临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康新西兰大白兔40只，♂，体质量2.5～3.0 kg，浙江中医药大学实验动物中心提供，实验动物合格证号：SCXK(浙)2008-0036。

1.1.2 药品 丹参酮针剂(上海第一生化药业有限公司，规格：2 mL︰10 mg，批号：100722)；葡萄糖注射液(杭州民生药业有限责任公司，批号：21011121)。

1.1.3 生化试剂与检测仪器 磷酸肌酸激酶(CK) (生产商：广州标佳，批号：103111)；肌酸激酶的同功酶(CK-MB)(生产商：英国朗道公司，批号：CK1553)；肌钙蛋白Ⅰ(Tn-Ⅰ)(生产商：美国BioMerieux，批号：1000498140)。

检测仪器：UniCel DxC800全自动生化分析仪(BECKMAN公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立及分组 将40只新西兰大白兔，♂，按成组设计应用随机列表法分成4组，每组10只。以3%戊巴比妥钠1.1 mL·kg-1经耳缘静脉注射麻醉，沿胸骨正中开胸，保持胸膜完整，将结扎线圈内置入硅胶管结扎左室缘支1 h，以心电图出现ST段弓背向上抬高2 mm为结扎有效，再松解2 h建立AMI及再灌注模型，假手术组只绕冠状动脉左室缘支穿线，不结扎。4组分别经耳缘静脉给药：葡萄糖再灌注组为对照组，再灌注前10 min缓慢注射25%的葡萄糖注射液2 mL·kg-1；丹参酮再灌注治疗组，再灌注前10 min耳缘静脉缓慢注射丹参酮ⅡA磺酸钠5.0 mg·kg-1溶于25%葡萄糖注射液1 mL·kg-1中；丹参酮冠脉结扎前治疗组，结扎前30 min耳缘静脉缓慢注射丹参酮ⅡA磺酸钠，剂量同丹参酮再灌注治疗组；假手术组，再灌注前10 min由耳缘静脉缓慢注射25%的葡萄糖注射液2 mL·kg-1。

1.2.2 血清样本制备方法 分别于结扎前5 min、结扎后1 h、再灌注后2 h，从颈总动脉取血4 mL，放入低温离心机中，3 500 r·min-1离心，10 min后取血清，-70 ℃保存。

1.2.3 生化指标检测方法 取制备好的血清样本，使用UniCel DxC800全自动生化分析仪(BECKMAN公司)对CK、CK-MB 以及Tn-Ⅰ浓度进行测定。

1.2.4 心肌梗死范围的测定 再灌注120 min后，立即取出心脏，沿心脏长轴分为5～6心肌短轴切片，再将整个心肌切片放入1%的四氮唑红(triphen yltetrazoliumchloride，TTC)溶液(pH 7.4)中，37 ℃孵箱中孵化15 min，梗死心肌不着色，非梗死部位心肌呈砖红色，对切片进行拍照。将录像中各个断面图像输入计算机，以Image-Pro Plus 6.0 图象处理软件计算各断面左心室室壁心肌面积(left ventricular myocardial area，LVMA)、梗死区心肌面积(myocardial infraction area，MIA)，以MIA与LVMA之比作为坏死心肌范围(MIA/LVMA/%)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各检测点组间血清学指标比较

与葡萄糖再灌注组比较，丹参酮再灌注组和丹参酮结扎前治疗组在再灌注后2 h的CK、CK-MB、Tn-Ⅰ显著减小，存在统计学差异(P＜0.05)。假手术组与其他3组比较，在再灌注后2 h的CK、CK-MB、Tn-Ⅰ均有统计学差异(P＜0.05)。结果见表1。

表1 各组兔CK、CK-MB、Tn-Ⅰ测定结果(n=10)Tab 1 The results of CK, CK-MB, Tn-Ⅰ(n=10)

2.2 冠脉结扎组间新西兰大白兔心肌梗死范围比较

与葡萄糖再灌注组比较，丹参酮再灌注组和丹参酮冠脉结扎前治疗组的心肌梗死范围明显减小(P＜0.05)，丹参酮再灌注组与丹参酮结扎前治疗组无统计学差异(P＞0.05)。结果见表2和图1。

表2 3组冠脉结扎组心肌梗死范围(n=10)Tab 2 The area of myocardial infarction(n=10)

图1 各组心肌梗死面积(不着色为梗死区域)A-葡萄糖再灌注组；B-丹参酮再灌注组；C-丹参酮结扎前治疗组；D-假手术组Fig 1 The area of myocardial infarction(no coloring)A-glucose reperfusion group; B-tanshinone reperfusion group;C-tanshinone pre-blocking treatment group; D-sham-operation group

3 讨论

3.1 心肌缺血再灌注损伤的发生机制

心肌缺血再灌注损伤是一种复杂的病理过程，其概念是在1960年由Jennings首先提出。心肌细胞发生缺血后，如果时间短，心肌尚处于可逆损伤的状态，随着时间的延长，心肌细胞的损伤呈进行性加重，当血供恢复后，缺血组织功能未能恢复甚至恶化，Moens等[1]认为心肌缺血再灌注损伤的主要机制可能是氧自由基生成、钙超载和白细胞激活。其再灌注后发生的损伤不仅包括组织器官的代谢紊乱、功能障碍，也包括组织结构的破坏。其临床后果有：①再灌性心肌顿抑(myocardial stunning)，即指心肌缺血再灌注后，心肌的力学功能需经一定时间，有时数天甚至数周后才能恢复；②再灌注性心律失常(reperfusion arrhythemia)，主要为室性期前收缩或室性心动过速；③心肌酶及钙蛋白亚单位漏出，心肌酶包括CK、乳酸脱氢酶以及心肌特有的CK同工酶，通过测定血清中这些酶升高的程度可反映心肌损害的程度。Tn-Ⅰ是心肌特有的抗原，对心肌损伤具有高度的特异性和敏感性，是反映IRI的敏感指标。

3.2 丹参酮对心肌缺血再灌注损伤的保护作用

丹参酮(tanshinone)是中药丹参根的乙醚或乙醇提取物，其含有的醌类成分参与生物体内多种生化效应，在体内可表现出多种生物活性。其对缺血再灌注损伤的心肌保护作用可能通过以下机制实现。

3.2.1 清除氧自由基，减少心肌细胞的损伤 已有实验证明[2]心肌缺血时心肌氧自由基大量产生，清除氧自由基的酶SOD活性下降，导致氧自由基在体内堆积，破坏了细胞膜的结构和功能，造成了心肌细胞损害。本实验中使用丹参酮治疗心肌梗死大白兔，结果表明心肌酶的溢出明显减少，可能与提高心肌组织缺血后SOD的活力，增强内源性氧自由基清除，减轻了缺血再灌注区组织细胞的损伤有关[3]，具体的作用机制还需进一步的实验证明。

3.2.2 钙通道阻滞作用，抑制细胞内钙超载 细胞内钙离子超载是心肌细胞损伤和不可逆坏死的共同通路，故降低细胞内钙离子浓度是防止或者减少心肌损伤的重要手段。孙学刚等[4]通过观察发现丹参酮可引起心肌细胞出现超级化转变，使细胞外钙内流减少，通过防止心肌细胞内钙超载而减轻心肌缺血后发生的再灌注损伤。研究还显示丹参酮能减少缺氧引起的线粒体钙内流，减少缺血再灌注损伤过程中，钙超载导致的ATP酶激活引起的ATP耗竭，从而保护线粒体。丹参酮是否通过钙通道阻滞作用使心肌细胞膜电位维持在正常水平，从而具有保护心肌的作用，值得做进一步的研究。

3.2.3 扩张冠状动脉侧枝血管，改善微循环，缩小心肌梗死面积 目前，多数人认为微循环障碍是心肌缺血再灌注损伤的重要机制，主要原因可能为毛细血管内皮的破坏以及微血栓或小动脉血栓形成。裴非等[5]通过大鼠实验发现，复方丹参滴丸能使原缺血部位心肌毛细血管墨汁灌流数明显增加，有效改善IR冠脉微循环缺血部位的血液灌流，缩小无复流面积。刘启功等[6]实验证实丹参注射液能促进冠脉侧枝循环的开放和形成，并认为前者可能与其冠脉扩张作用有关，后者可能与丹参能使心肌血管内皮生长因子(VEGF)表达上调有关。张洁等[7]发现丹参酮对原代培养猪冠脉平滑肌上ATP敏感的钾通道和钙激活钾通道均有直接激活作用，并由此推测可能由于上述通道的开放协同钙通道阻滞作用可引起冠脉舒张，改善冠脉平滑肌的功能状态。本实验的研究显示使用丹参酮治疗后，与对照组大白兔的心肌梗死面积有统计学差异，支持这种推测，其具体机制有待更多深入的研究。

REFERENCES

[1] MOENS A L, CLAEYS M J, TIAMERMAUS J P. Myocardial ischemia/reperfusion - injury, a clinical view on a complex pathophysiological process [J]. Int J Cardiol, 2005, 100(2): 179-190.

[2] GUO Q, CHEN S Y, YAO X J, et al. Protective effect of corocinnarine on ischemia - reperfusion myocardium of rats and its relation to anti-lipid peroxidation [J]. Chin Heart J(心脏杂志), 2002, 14(1): 4-6.

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[6] LIU Q G, SUN Y M, CHEN Y X, et al. Restrictive effect of Salvia miltiorrhiza on myocardial infarct area in dogs and its possible mechanism [J]. China J Mod Med(中国现代医学杂志), 2005, 15(15): 2257-2259.

[7] ZHANG J, ZENG X R, YANG Y, et al. Effect of sodium tanshinone ⅡA on KATP, BKCa of coronary artery smooth muscle of primary porcine cells [J]. J Luzhou Med Coll(泸州医学院学报), 2000, 23(3): 177-179.

Myocardium Protection of Tanshinone on Ischemia Reperfusion Injury of Rabbits with Acute Myocardial Infarction

ZHANG Huihui1,2, HUANG Shuwei2*, WANG Linli2, LIN Dongming2
(1.First People’s Hospital of Yuhang District, Hangzhou 311100, China; 2.Department of Cardiology, the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Traditional Chinese Medicine University, Hangzhou 310005, China)

OBJECTIVE To explore the effect of tanshinone on ischemia reperfusion injury of rabbits after acute myocardial infarction, and to supply the experimental proof for the clinic. METHODS Divide 40 male rabbits into 4 groups, 10 per group: glucose reperfusion group, tanshinone reperfusion group, tanshinone pre-blocking treatment group and sham-operation group. Reperfusion injury model was established and the drug was administrated intravenously. Blood was collected to test the CK, CK-MB, Tn-Ⅰ at the time of 5 min pre-blocking, 1 h post-blocking and 2 h post reperfusion. 1% Triphenyltetrazolium chloride was used to produce myocardial incision. AutoCAD 2002 software was applied to calculate the area of myocardial infarction. RESULTS ①Tanshinon e reperfusion group and glucose reperfusion group had significant differences in CK, CK-MB, Tn-Ⅰ after 2 h reperfusion(P＜0.05). Tanshinone pre-blocking treatment group and glucose reperfusion group had significant differences in CK, CK-MB, Tn-Ⅰ after 2 h reperfusion(P＜0.05). Tanshinone reperfusion group and tanshinone pre-blocking treatment group had no significant differences in CK, CK-MB after 2 h reperfusion(P＞0.05), and had significant differences in Tn-Ⅰ after 2 h reperfusion(P＜0.05). ②The area of myoc ardial infarction between tanshinone reperfusion group and glucose reperfusion group, tanshinone pre-blocking treatment group and glucose reperfusion group had significant differences(P＜0.05). The area of myocardial infarction between tanshinone reperfusion group and tanshinone pre-blocking treatment group had no significant differences(P＞0.05). CONCLUSION Tanshinone can lower CK, CK-MB, Tn-Ⅰ of rabbits with acute myocardial infarction, and can decrease the area of myocardial infarction.

tanshinone; ischemia reperfusion injury; myocardium protection

R285.5

A

1007-7693(2013)10-1062-05

2013-03-29

浙江省中医药科技计划项目(2009CA038)

章慧慧，女，硕士 Tel: 15905712748 E-mail: zhhzju@163.com*

黄抒伟，男，硕士，主任医师，硕导 Tel: 13957121104 E-mail: shuwei@hotmail.com