不同花色野生百合色素成分分析1)

夏 婷 耿兴敏 罗凤霞

(南京林业大学，南京，210037) (金陵科技学院)

在百合育种中，花色是衡量百合观赏价值的一个重要标准。国外有关百合花色的研究已有大量报道。Banba 等在有关日本百合色素资源的调查中发现大多数亚洲百合中的黄色和橙色百合中主要含有类胡萝卜素，粉色百合主要含有花青素，而百合花瓣中的花斑也主要是由花青素引起的［1－2］。根据亚洲百合和东方百合的10 个杂交品种的花色素苷成分分析结果，可以看出，百合红色花瓣中主要含有原花青素、矢车菊色素3－O－β 芸香糖苷7 －O－β －葡糖苷和矢车菊色素3－O－β 芸香糖苷，而非白色花瓣中总含有原花青素［3］。近年来，国外在百合花色成分分析研究的基础上，对百合花色的分子遗传机理和基因调控等已有大量报道。研究表明，花青素苷的合成是由一对显性基因控制的，并且花瓣与花斑中花色素苷的合成是独立遗传的，而类胡萝卜素的合成受多个基因的影响［4－6］。查尔酮合酶(CHS)和黄烷酮醇4 －还原酶(DFR)是控制亚洲杂交系百合的花瓣及花斑花色素苷累积形成的关键酶［4］，R2R3 －MYB 类转录因子LhSorMYB12 控制了东方系百合索邦的花色素合成，且与东方系百合花瓣颜色不同相关［7］。

我国有约47 个种18 个变种，其中36 个种15个变种为我国特有种［8］，占世界野生百合资源的半数以上，种类及花色资源非常丰富。但对中国野生百合的色素资源调查、色素成分的鉴定、分离、结构分析等还未见报道。因此，本研究以中国野生百合4 个组13 个种为主要试验材料，对其花色、基本色素成分进行了初步分析，为其色素成分的进一步定性、定量分析提供理论依据，为我国花色育种提供理论基础及参考依据，从而促进我国百合的花色育种进程。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2009年和2010年秋季陆续收集到分属百合属4 个组的13 个种的种球，然后栽植于南京林业大学温室。具体种类、分类及来源见表1和图1。

1.2 试验方法

1.2.1 不同花色百合的花色测定

在百合盛开状态下，每个种随机选取5 个不同单株，取新鲜花瓣，在室内自然光条件下，将花瓣最宽部分与英国皇家园艺学会比色卡(RHSCC)进行对比。同时，用色差仪(NF333 spectrophotometer，Nippon denshoku，光源C/2°)测量花瓣最宽部分的亮度L*和两个色度成分a*值(从绿色到红色)及b*值(从蓝色到黄色)，取平均值。使用国际照明委员会(International Commission on Illumination，CIE)系统进行分析。色度C*=(a*2+b*2)1/2和色度角h=arctan(b*/a*)。

表1 试验材料

图1 百合种类

1.2.2 不同花色百合的显色反应

每个种随机选择5 个单株，取下花瓣，去除花斑部分，剪碎后混匀，分别取0.1 g 新鲜花瓣，用10%盐酸和石油醚研磨过滤，观察研磨液的颜色变化。百合的花斑部分单独测试。同时用25%氨水进行气熏，观察百合花瓣颜色变化［9－10］。

1.2.3 不同花色百合的紫外光谱分析

收集盛花期花瓣，去掉中梗，剪碎，分装成3.5 g左右的小袋，用液氮速冻后放入－85 ℃贮藏。注意将带花斑的百合，花斑部分和不带花斑部分分开剪装。所有样品收集完后，统一用冷冻干燥机干燥。干燥后的花瓣样品，放入冰箱－25 ℃干燥保存待用。各色素成分样品分析均使用0.02 g 干燥花瓣。

花瓣中叶绿素的检测:用V(丙酮)∶ V(乙醇)=9∶ 1 溶液提取，过滤并定容至5 mL。用岛津公司生产的UV—1700 型紫外可见分光光度计在400 ～700 nm 扫描，比色皿光径为1 cm。叶绿素的特征吸收峰出现在662、644 nm 附近［11］。

花瓣中类胡萝卜素的检测:用V(石油醚)∶ V(丙酮)=1 ∶ 1 溶液提取，过滤定容至6 mL。在200 ～700 nm 扫描。类胡萝卜素的特征吸收峰出现在440、470 nm 附近［11］。

花瓣中类黄酮的检测:黄色系和白色系的样品加盐酸化甲醇(pH =3)2 mL 置于冰箱中4 ℃提取24 h;红色系、紫色系、粉色系和橙色系加V(HCl)∶V(MeOH)=1∶ 99 混合液2 mL 放在常温下(大约25 ℃)避光提取24 h。过滤定容至10 mL，在220 ～600 nm 扫描。黄酮类化合物一般有2 个吸收带，分别是240 ～285 nm 和300 ～550 nm。甲醇溶剂提取的花色素苷最大吸收波长在520 ～560 nm［11－12］。

1.2.4 不同花色百合类黄酮的特征显色反应

称取干燥的花瓣粉末0. 1 g，用V(HCl)∶ V(MeOH)=1∶ 99 的盐酸化甲醇溶液提取15 h，过滤并定容至25 mL，备用［13－15］。

浓盐酸—镁粉反应:取2 mL 提取液，加入少量镁粉并加5 滴浓盐酸，摇匀，静置1 h。

浓盐酸—锌粉反应:取2 mL 提取液，加入少量锌粉并加10 滴浓盐酸，摇匀，静置1 h。

金属盐类试剂的络合反应:三氯化铝反应，取2 mL 提取液，加1.0%的AlCl3·6H2O 甲醇溶液1 mL。

醋酸铅反应:取2 mL 提取液，加1. 0% 的Pb(CH3COO)·3H2O 溶液2 mL，摇匀，静置2 h。

氨性氯化锶反应:取2 mL 提取液，加10 滴0.01 mol·L－1的SrCl2·6H2O 甲醇液，再加10 滴被氨水饱和的甲醇液(取甲醇10 mL，加氨水定容至25 mL)，摇匀，静置1 h。

三氯化铁反应:取2 mL 提取液，加5. 0% 的FeCl3·6H2O 溶液2 mL。

硼酸反应:取2 mL 提取液，加10 滴1.0%的H2O2C4·2H2O 溶液，再加3 mL 2. 0%的H3BO3溶液。

2 结果与分析

2.1 不同花色百合的花色测定结果

根据比色卡比较结果以及色差“CIELAB”分布(表2、图2)，将试验中所用百合初步分为四大色系:橙色系(O)包括毛百合、有斑百合、细叶百合、兰州百合、卷丹、大花卷丹、轮叶百合;紫色系(P)包括鹿子百合、垂花百合;黄色系(Y)包括通江百合(2009)、岷江百合(下部);白色系(W)包括岷江百合(上部)、宝兴百合、通江百合(2010)、铁炮百合。虽然，岷江百合花瓣基部呈现黄色，但仍将其归于白色系(W)。2009年收集的通江百合，收获子球，在第二年栽植后，或许因种球的退化及环境的不适应性，花色变浅，基本呈白色。

表2 百合花色测定结果

图2 不同花色百合的“CIELAB”分布

2.2 不同花色百合的显色分析结果

氨水、10% HCl 及石油醚显色反应结果如表3所示。观察石油醚研磨过滤液颜色，橙色系的所有百合、白色系的岷江百合下部的过滤液呈现不同程度黄色，说明其含有类胡萝卜素，其中有斑百合类胡萝卜素含量较高，其次是毛百大花卷丹和轮叶百合等，而兰州百合、卷丹的类胡萝卜素含量较低。观察10% HCl 研磨过滤液颜色，紫色系的百合显色结果表明其含有花青素，紫色系的鹿子百合和垂花百合氨水气熏后花瓣颜色变绿，是由花色苷呈现的蓝色和类黄酮呈现的黄色混合而成，说明其同时含有类黄酮和花青素苷，而鹿子百合的花瓣白色边缘变黄，说明其含有黄酮色素;白色系百合及黄色系百合的百合花瓣氨水测试中也显色不同程度的黄色，说明其可能含有黄酮或黄酮醇色素。花斑部分10%HCl 研磨过滤液颜色显红色，说明其含有花青素，氨水测试后颜色发蓝黑色，进一步说明其含有花色素苷(数据未显示)。

表3 不同百合的显色反应结果

2.3 不同花色百合的紫外扫描分析

不同花色百合的紫外扫描结果如表4所示。橙色系的轮叶百合、白色系的岷江百合(下部)、铁炮百合、通江百合(2010)以及黄色系(2009)的紫外扫描时，均在662 nm 附近出现了吸收峰，虽然吸收值很微小，但还是说明这些百合花瓣中含有微量的叶绿素，这也或许因为取样时靠近花瓣中脉部分所致。

橙色系所有百合，白色系的岷江百合(下部)，黄色系的通江百合(2009)、黄百合在440、470 nm 附近都有吸收峰，说明这些百合的花瓣中含有类胡萝卜素。白色系的铁炮和通江百合(2010)在440 nm附近有吸收峰，但吸收值很小，说明可能含有微量类胡萝卜素。这在石油醚显色反应中没被观测到，或许与类胡萝卜素的含量较低有关，也说明通江百合在第2年栽植时花色变浅可能与花瓣中类胡萝卜素含量减少有关。

紫色系的所有百合在530 nm 附近均出现了吸收峰，说明这些百合花瓣中均含有花色素苷。所有百合均在240 ～285 nm 和300 ～550 nm 出现吸收峰，说明上述百合花瓣中含有其他类黄酮化合物。

2.4 不同花色百合的类黄酮特征显色分析结果

不同花色百合的类黄酮特征显色反应结果如表5所示。

2.4.1 还原反应

橙色系的毛百合、有斑百合、卷丹、大花卷丹、轮叶百合，紫色系的鹿子百合、垂花百合，白色系的岷江百合(上部)、宝兴百合、通江百合(2010)以及黄色系的通江百合(2009)与浓盐酸加镁粉或锌粉反应呈现橙红～紫红色，说明可能含有黄酮、黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物。结合单独浓盐酸反应做对照，紫色系的鹿子百合、垂花百合及其他色系带花斑的百合花斑部分均出现不同程度的红色，说明其含有花色素。

2.4.2 金属盐类试剂的络合反应

三氯化铝反应:白色系的宝兴百合、岷江百合(上、下部分)、铁炮百合、通江百合(2010)及黄色系的通江百合(2009)表现为极淡黄色，意味着黄酮的存在。

醋酸铅反应:橙色系的毛百合、有斑百合、细叶百合、兰州百合、卷丹、大花卷丹、轮叶百合，紫色系的鹿子百合、垂花百合均出现黄至红色沉淀，说明其具有邻二酚羟基或兼有3—OH，4 ＝O 或5—OH，4 ＝O 的化合物，并表明了其不含查耳酮和橙酮。

氨性氯化锶反应:橙色系的卷丹、大花卷丹，紫色系的鹿子百合、垂花百合，白色系的铁炮百合，产生了黄色、绿色～棕色沉淀，意味着色素分子中有邻二酚羟基结构的黄酮类化合物。

三氯化铁反应:多数黄酮类化合物因分子中含有游离酚羟基，与三氯化铁水溶液或醇溶液可产生阳性反应，呈现颜色;当含有氢键缔合的酚羟基时，颜色更明显。紫色系的鹿子百合、垂花百合，白色系的岷江百合(上、下部分)、通江百合(2009，2010)、宝兴百合、铁炮百合反应溶液均出现了不同程度的绿色，说明其黄酮类化合物含有酚羟基。

表4 不同百合花瓣中叶绿素、类胡萝卜素及类黄酮紫外扫描特征吸收峰

表5 不同颜色百合的类黄酮特征显色反应

2.4.3 硼酸反应

所有色系的百合与硼酸反应均未出现亮黄色，说明所有百合均不含有5 －羟基黄酮及2’－羟基查尔酮。

3 结论与讨论

本研究所用的13 种不同花色百合主要被划分为4 个色系:橙色系、紫色系、白色系和黄色系。同一色系的品种其花瓣颜色深浅、亮度(测定值未显示)等也存在很大差异。

不同花色的色素成分存在差异，但光谱扫描结果显示，所有百合花瓣都含有类黄酮化合物(不包括花色素苷)。石油醚显色反应和光谱扫描结果均说明橙色系百合色素主要由类胡萝卜素构成，这与Nakano et al.［6］研究发现亚洲杂交百合中橙色与黄色百合中主要含有类胡萝卜素一致。而还原反应则显示有斑百合、卷丹、大花卷丹和轮叶百合可能还含有黄酮、黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物。10%盐酸显色反应和光谱扫描结果表明紫色系百合花瓣主要含有花色素苷，这与张圆圆等［16］通过对不同花色向日葵检测以及张洁等［17］对显现不同程度红色贴梗海棠检测发现花色素苷是红色及紫色的主要色素成分结论一致。氨水测试则表明其还同时含有类黄酮物质，通过还原反应进一步分析表明这些类黄酮物质可能是黄酮、黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物。还原反应结果显示白色系和黄色系百合(除铁炮百合外)花瓣也含有以上类似物质，三氯化铝试剂的络合反应则进一步表明岷江百合、通江百合及铁炮百合花瓣含有黄酮色素，氨水测试反应中白、黄色系的百合花瓣呈现不同程度的黄色，说明其含有黄酮或黄酮醇。岷江百合下部黄色的花瓣中还检测到类胡萝卜素的存在。另外，光谱扫描结果还显示铁炮百合和2009年栽培的通江百合中含有少量的类胡萝卜素，但峰值不明显，可能是其含量较低的原因。轮叶百合、铁炮百合、通江百合(2010 栽培)等部分百合花瓣中还检测到了极微量的叶绿素存在，也可能取样部位接近叶脉所致，这需要进一步的分析。

所有带花斑的百合花瓣均检测到花色素苷的存在，这与之前学者的研究一致［4］。百合花色通常有多种色素共同显色所致，特征显色反应和紫外分光光度计扫描只是对百合花色的初步定性分析，还需要结合高效液相色谱、质谱、核磁共振等方法对色素的成分进行进一步分析。另外，在本研究中收集材料有限，中国野生百合中还有很多珍惜花色品种，如绿花百合(Lilium fargesii)、紫花百合(Lilium souliei)等，还有待于进一步的分析、研究。

［1］ Banba H. Pigments of lily flowers I. survey of anthocyanin (in Japanese)［J］. Jpn Sci Hort Sci，1967，36(4):433 －437.

［2］ Banba H. Pigments of lily flowers Ⅱ. Survey of carotenoid (in Japanese)［J］. Jpn Sci Hort Sci，1968，37(4):72 －82.

［3］ N∅rbaek R，Kondo T. Anthocyanins from flowers of Lilium (Liliaceae)［J］. Phytochemistry，1999，50:1181 －1184.

［4］ Abe H，Nakano M，Nakatsuka A，et al. Genetic analysis of floral anthocyanin pigmentation traits in Asiatic hybrid lily using molecular linkage maps［J］. Theor Appl Genet，2002，105:1175 －1182.

［5］ Nakatsuka A，Izumi Y，Yamagishi M. Spatial and temporal expression of chalcone synthase and dihydroflvonol 4-Reductase genes in Asiatic hybrid lily［J］. Plant Science，2003，165:759 －767.

［6］ Nakano M，Nakatsuka A，Nakayama M，et al. Mapping of quantitative trait loci for carotenoid pigmentation in flower tepals of Asiatic hybrid lily［J］. Scientia Horticulturae，2005，104:57 －64.

［7］ Yamagishi M. Oriental hybrid lily Sorbonne homologue of Lh-MYB12 regulates anthocyanin biosyntheses in flower tepals and tepal spots［J］. Mol breeding，2010，28:381 －389.

［8］ 赵祥云，王树栋，陈新霞，等. 百合［M］. 北京:中国农业出版社，2000:56 －60.

［9］ 安田齐. 花色的生理生物化学［M］. 北京:中国林业出版社，1989:15 －54.

［10］ 赵昶灵，郭维明，陈俊愉.梅花花色色素种类和含量的初步研究［J］.北京林业大学学报，2004，26(2):68 －73.

［11］ 白新祥，胡可，戴思兰，等. 不同花色菊花品种色素成分的分析［J］.北京林业大学学报，2006，28(5):84 －89.

［12］ 马卡姆K R.黄酮类化合物结构鉴定技术［M］.北京:科学出版社，1990:42 －45.

［13］ 张培成. 黄酮化学［M］. 北京:化学工业出版社，2009:228 －230.

［14］ 张剑亮，何琴，潘大仁，等. 观赏向日葵花瓣色素成分分析［J］.广东农业科学，2011(8):125 －129.

［15］ 赵昶灵.几个梅花品种花色的时空变化、花色苷的分子结构和F3’H 克隆的研究［D］.南京:南京农业大学，2005.

［16］ 张圆圆，齐冬梅，刘辉，等. 观赏向日葵的花色多样性及其与花青苷的关系［J］.园艺学报，2008，35(6):863 －868.

［17］ 张洁，王亮生，高锦明，等. 贴梗海棠花青苷组成及其与花色的关系［J］.园艺学报，2011，38(3):527 －534.