油松枯枝病病原菌的越冬方式及场所1)

高国平 李美卉 祁金玉 张中一 王月 杨 晨 王 红

(沈阳农业大学，沈阳，110866)

油松(Pinus tabulaeformis Carr.)是辽宁省乡土树种，也是辽宁省重要的用材林和绿化树种，但是近几年，油松枯枝病在辽宁沈阳地区油松枝条上陆续发生，常成大量的油松枝条死亡，严重者甚至导致全株枯死。油松枯枝病的病原菌为铁锈薄盘菌(Cenangium ferruginosum)和松梢枯丛赤壳菌(Nectria cucurbitula)，其无性分别是针叶树歧裂壳菌(Dothichiza ferruginosa)和瘤座孢菌(Tubercularia sp.)［1－3］。我国目前有关松枝枯病的报道极少，仅见对松枯枝病的病原菌、生物学特性及防治技术的报道［4］，但关于油松枯枝病病原菌越冬场所及方式还缺乏研究。笔者在沈阳地区对油松枯枝病原菌的越冬方式及其越冬场所开展了研究，对于完善该病害的基础理论及生产防治有重要意义。

1 研究区自然概况

辽宁省沈阳地区位于中国东北地区的南部，地处东经122°25'09″ ～123°48'24″、北纬41°11'51″ ～43°02'13″，东西长115 km2，南北长205 km2，属于北温带亚洲季风气候区的北缘，受季风影响的湿润和半湿润暖温带大陆性气候，年均气温7.4 ℃，极端最高温度38 ℃，极端最低温度－30.5 ℃，年均日照2 596.3 h，年平均无霜期155 d，年平均降水量750 mm，年蒸发量1 382 mm。

2 研究方法

2.1 越冬病原子实体观察

于2011年12月至2012年2月，在沈阳市沈阳农业大学校园内、棋盘山风景区及铁西区劳动公园、和平区中山公园、和平区南湖公园、沈阳市抗美援朝烈士陵园等油松风景林内，随机抽取发病木，借助放大镜，用肉眼观察其树上的枯死枝条、褪绿枝条、落地枝条上是否有油松枯枝病病原子实体，并做详细记录。将观察到带有子实体的枯死枝条标明编号、采集地点、采集时间，用塑料袋分装保存带回实验室备用［5］。在室内做病理切片后镜检，根据形态特点鉴定病原子实体有性、无性态的种类。

2.2 越冬病原营养体的检测

病原营养体的分离培养:在8 个调查地点采集表面无病原子实体的健康枝条，每个地点采集3 段长15 ～20 cm 的样枝，带回室内。采用常规的组织分离法，将样枝的皮层切成0.5 cm ×0.5 cm 的小段，经0.1%的升汞溶液消毒后，用PDA 培养基培养，一个培养皿中放3 段组织(等腰三角状)。置于LRH－250 －G 光照培养箱中，在室内黑暗25 ℃恒温条件下培养，每天观察一次并记录培养菌落的形状、色泽及拍摄照片等。将出现的菌落进行纯化再培养，与该病害病原菌子实体分离出的菌株外部形态特征进行对比。最后将获得菌株编号保存在PDA 试管斜面上待用［6］。

病原营养体的分子检测:对获得的菌株分别提取其DNA，并以其为模板，采用ITS 通用引物(ITS1:5'－TCCG TAGG TGAA CCTG CGG－3'和ITS4:5'－TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC－3')对菌株的rDNA ITS序列进行PCR 扩增。对此片段进行DNA 序列测定，DNA 提取及测序工作由大连宝生物工程有限公司完成。同时以该病害病原菌分离菌株的DNA 序列作为对照，将所测菌株的基因序列和对照菌株的基因序列用DNAMAN 软件进行同源性比较分析，最后确定测定菌株的种类是否属于油松枯枝病原菌种类［7－9］。

3 结果与分析

3.1 病原子实体的越冬形式与场所

野外观察只在油松枯死枝条上发现了2 种病原菌的有性、无性子实体。一般一个枝条上可见同一病原的无性和有性子实体，但也偶见同一枝条上2 种真菌的无性、有性子实体混生现象。从越冬场所来看，仅见枯死枝条上存在子实体，而落地枝条和树上褪绿枝条上未检查到病原子实体的存在。具体见表1。

表1 油松枯枝病野外越冬有性、无性子实体存在情况

3.2 越冬营养体的检测

3.2.1 病原菌的分离培养特征

在8 个样地分离的33 个样品中分离获得3 个菌株，其中劳动公园分离出1 个菌株(A)，中山公园分离出2 个菌株(B1、B2)，详见表2。

表2 油松枯枝病病原菌分离培养记录

获得的3 个菌株形态为黄褐色圆形菌落;气生菌丝，初期为白色绒毛状，逐渐变黄褐色。3 个菌株的外部形态特征与铁锈薄盘菌菌株的外部形态完全相似，与松梢枯丛赤壳菌有明显区别。其它30 个分离样品中，一些没有长出菌落，一些虽长出菌落但却是橘红色或灰绿色的细菌或霉菌污染菌落。未分离出的原因可能是采集的样枝没有被病原菌侵染，或者分离过程被污染而失败。

3.2.2 病原营养体的分子检测结果

对菌株A、菌株B1、菌株B2、菌株CK 的rDNA ITS 测序结果表明:菌株A 的ITS 序列长度为516 bp，菌株B1 的ITS 序列长度为514 bp，菌株B2 的ITS 序列长度为517 bp，对照菌株CK 的ITS 序列长度为517 bp(具体见下列菌株扩增片断)。将4 个菌株的基因序列用DNAMAN 进行同源性分析，去掉头部和尾部可能造成测序不准确的碱基，其他碱基完全一致，表明它们属于同一物种。从培养的菌落形态和DNA 检测结果可以确定从油松褪绿枝条皮下分离出的3 个菌株为铁锈薄盘菌。各样品基因片断序列分别为:

4 结论与讨论

油松枯枝病病原菌铁锈薄盘菌和松梢枯丛赤壳菌都存在着有性子实体、无性子实体的越冬形式，而以营养体菌丝越冬的仅见于铁锈薄盘菌。2 种病原菌的子实体一般在树木当年生的枯死枝条上越冬，而铁锈薄盘菌的营养体菌丝则在油松健康枝条的皮下越冬。油松树上褪绿枝条和落地枝条上未发现油松枯枝病2 种病原菌子实体存在。健康或褪绿枝条的皮下也未分离到松梢枯丛赤壳菌的营养体菌丝。枯枝上以铁锈薄盘菌子实体居多，偶见2 种病原菌无性和有性子实体混生共存。

铁锈薄盘菌和松梢枯丛赤壳菌均为弱寄生菌，在多种松树上存在，前人仅发现了铁锈薄盘菌以营养体菌丝的形式越冬［10］。本研究表明铁锈薄盘菌不仅以营养体菌丝的形式越冬，还以有性、无性子实体的形式在树木当年生枯死枝条上越冬。但在油松枯死枝条上残存的2 种病原菌子实体对油松的侵染能力，有待进一步研究。

［1］ 高国平，王允，祁金玉，等.沈阳市城区油松枝枯病病情及分析［J］.西北林学院学报，2012，27(3):105 －108.

［2］ 黄国强，李超，王庆华，等.松烂皮病发生规律与防治对策［J］.山东林业科技，2003 (4):33.

［3］ 孙美清，杨秀卿，赵伟，等.松树枝枯病的研究进展［J］.中国森林病虫，2001(4):27 －31.

［4］ 葛芳，张瑶琦，张浩洋，等.油松枯枝病病原菌生物学特性的研究［J］.辽宁林业科技，2009(4):21 －22.

［5］ 方中达.植病研究方法［M］.北京:中国农业出版社，1998.

［6］ 陆燕君. 松树枝枯病的发生与防治［J］. 山东林业科技，1990(3):34 －35.

［7］ 魏作全，黄桂菊，黎明，等.红松烂皮病病原鉴定及致病性研究［J］.沈阳农业大学学报，1990，21(2):115 －118.

［8］ 霍玉林，李广武.烟台赤松衰弱与死亡因子的探讨［J］.森林病虫通讯，1990(3):21 －22.

［9］ 魏作全，黄桂菊，黎明，等.红松烂皮病病情及发病规律的研究［J］.沈阳农业大学学报，1991，22(4):296 －301.

［10］ 张成丕，刘晓东，董晓彤.黑松枝枯病的综合防治技术［J］.防护林科技，2000(3):113 －114.