菲降解菌巨大芽孢杆菌在土壤中的运移规律

耿 婧，于少云，寇 尧，周 延

（北京化工大学生命科学与技术学院制药工程系，北京100029）

多环芳烃是重要的环境和食品污染物，相当一部分具有致癌性，自然降解速度极慢，已成为当今环境策略的重要议题。现在已发现微生物具有快速降解多种多环芳烃的能力，因此原位微生物修复技术是治理土壤污染的优选措施之一［1］。为了更好地指导微生物的环境修复，人们对微生物在土壤中的迁移模型做了大量研究，这些模型都是针对某种特定微生物，在对流－弥散方程基础上综合考虑微生物的生长－衰亡、吸附－解吸的结果。研究发现，土壤颗粒表面对微生物的吸附解吸作用是影响其迁移最主要的因素，几乎影响微生物迁移的所有因素 （如静电作用力、范德华力、疏水作用力等）都是通过影响吸附解吸来起作用的。若将微生物视做具有一定吸附－解吸特性的某种物质进行研究，所有影响微生物表面特性的理化因素都将影响该过程，这些因素主要包括微生物的体积、鞭毛运动、形状系数、表面电位、细胞膜组成等。本研究希望通过对不同微生物的表面特性因素与吸附－解吸表观常数的测定与分析，探索寻找微生物运移中影响其吸附－解吸特性的一些共性规律。

研究首先对本实验室选育的具有多环芳烃降解能力的巨大芽孢杆菌在土壤中的运移模型各项参数进行了实验测定，然后选择了对6种在体积、鞭毛运动、形状系数、表面电位、细胞膜组成等方面具有一定差异的微生物，测定其在土壤中的吸附解吸过程，探寻这些影响表面特性的参数对其在土壤中吸附常数与解吸常数的影响。

1 材料和方法

（1）供试菌种：巨大芽孢杆菌 （本实验室自有菌）、假单胞菌 （本实验室自有菌）、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、微球菌。

（2）供试土壤：供试土壤采自于北京化工大学，采回的土样除去土壤中的碎石、枯枝败叶，风干后过2 mm筛、待用。

（3）TY培养基：葡萄糖10.0 g，酵母膏5.0 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，无机盐基础培养液2.0 mL，加去离子水至1 L，调p H值至7.5，115℃高压灭菌30 min。

（4）无机盐基础培养液：NaNO34 g，KH2PO41.5 g，Na2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl20.01 g，FeSO4·7H2O 0.0011 g，加去离子水至1 L，121℃高压灭菌30 min。

（5）菌悬液的制作：巨大芽胞杆菌接种于液体培养基中富集培养16～24 h后，6000 r／min，10 min离心收集菌体，磷酸缓冲液洗涤，重悬于磷酸缓冲液中，做成菌悬液。

（6）砂土的处理：将过2 mm筛的砂土浸在稀盐酸溶液中，24 h后，用自来水冲洗至p H值中性，再用去离子水冲洗两遍，烘干。然后装在锥形瓶中灭菌3 h。

（7）平衡吸附试验：采用批量平衡法测定了菌在砂土表面的吸附。本实验5个菌悬液的梯度浓度分别为0.1×108CFU／m L、0.5×108CFU／m L、1.0×108CFU／m L、1.5×108CFU／m L、2.5×108CFU／m L，每组设2个平行样。按1∶2的土水比加入灭菌土样并将锥形瓶密封，置于恒温摇床中进行振荡（恒温30℃，转速120 r／min）。

（8）动力学实验：按照张瑞玲等［4］提到的微生物在土壤中吸附动力学的研究方法，用间歇法确定吸附平衡时间。将在富集培养基上生长24 h后的菌体以6000 r／min离心10 min收集菌体，用磷酸缓冲液洗涤两次，重悬于磷酸缓冲液中，装入250 mL锥形瓶中，制得一定初始浓度的菌液。之后，按1∶2的土水比加入灭菌土样，置于恒温摇床中进行振荡 （恒温30℃，转速150 r／min）。每10 min从中取出一次样品，静置0.5 h，取上清液测定菌体个数。每个浓度重复3次。

（9）弥散系数测定实验：采用土柱实验，0.01 mol／L NaCl溶液，测定出口处Cl－的浓度，Cl－的测定用Ag N03滴定法。

（10）生长项系数测定实验：微生物在土壤中的迁移往往忽略微生物的生长，采用Monod方程［4］计算微生物在土壤中迁移过程的生长项系数，用微生物降解菲的实验数据进行拟合。降解条件为：摇床转速150 r／min，温度28℃，p H值为7.0，初始巨大芽胞杆菌浓度1 mg／L，底物浓度（即葡萄糖浓度）1 g／L。

2 数学模型

本实验选用一级动力学吸附模型［5］来描述细菌在土柱中的运移模型，有以下4个假设前提：①土壤是匀质体；②水流恒定；③土壤孔隙率恒定；④微生物细胞在液相中均匀悬浮。在上述前提条件下，菌的运移方程如式 （1）。

式中，θ为介质体积含水率，对于饱和土壤，则是介质有效孔隙度；C为微生物在水相中的浓度，mg／m3；S为微生物在固体表面可逆吸附的菌浓度，mg／g；ρ为土壤的容重，g／m3；D为水动力弥散系数，m2／s；v为流速，m／s；katt为可逆吸附常数，s－1；kdet为可逆解吸常数，s－1；σ为微生物的比增长速率，T－1。

等式左边表示微生物的积累，右边第一项为水动力弥散项，第二项为对流项，第三项为吸附项，第四项为解吸项，第五项为微生物生长衰亡项。

3 结果与讨论

3.1 巨大芽孢杆菌在土壤中的运移模型

3.1.1 平衡吸附参数

图1 巨大芽孢杆菌在土壤中的等温吸附线

土壤颗粒表面对微生物的吸附是物理化学作用，主要范德华力、静电作用力、疏水作用力等。常见的等温吸附模型有以下4种：线性平衡吸附、Freundlich平衡吸附、Langmiur平衡吸附、Temkin平衡吸附。根据测定菌液平衡浓度和质量进行计算，可得到最适吸附模型。图1为巨大芽孢杆菌4种吸附模型的回归曲线，可以看出该巨大芽孢杆菌最符合Freundlich平衡吸附模型，相关性为99.4%。实验测得该巨大芽孢杆菌在砂土中的平衡吸附参数为2.307 mL／g。

3.1.2 动态吸附参数

按照第1节所提到的方法，首先确定巨大芽孢杆菌在土壤中达到吸附平衡的时间，如图2所示，约在1 h内吸附达到平衡，然后选择吸附平衡前的时间范围内考察其动态吸附。在已知土壤有效孔隙度和土壤容重的条件下，采用Sim［6］提出的一般情况下等温过程可逆吸附形式，见式 （2）。

图2 巨大芽孢杆菌吸附随时间的变化

图3 巨大芽孢杆菌在土壤中的动态吸附

3.1.3 弥散系数与生长项系数

土柱实验中水流速度恒定，用Cl－浓度的BTC拟合得到弥散系数D为3.2×10－6cm2／s。采用最小二乘法拟合得到巨大芽孢杆菌的生长项系数为3.97×10－9。约为其它项系数的10－4倍，所以本实验中巨大芽孢杆菌的生长项系数可以忽略不计，也就是说巨大芽孢杆菌的生长衰亡率对其在土壤中运移的影响可以忽略。

3.1.4 巨大芽孢杆菌的模型

根据上述实验结果得到该巨大芽孢杆菌在土壤中运移模型的各项参数，在30℃，1 g／L葡萄糖浓度条件下忽略该巨大芽孢杆菌的生长项系数，得到的方程如式 （3）。

3.2 表面参数对菌在土壤中吸附－解吸的影响

批量平衡法测定吸附的结果表明，巨大芽孢杆菌、假单胞菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及微球菌在砂土上的吸附符合Freundlieh方程，即S＝KCn。金黄色葡萄球菌在沙土上的吸附符合线性平衡吸附方程，即S＝KC。

根据第1节的实验方法和第3.1节的求解方法求其余5种菌体的吸附常数katt、解吸常数kdet。6种菌体的物理性质和吸附解吸常数结果见表1。

与水对流相比较，微生物自身趋化运动很小，往往可以忽略。仅在静态的条件下，趋化作用才变得比较明显。本实验采用动态实验，故可考虑忽略微生物的趋化运动，即忽略微生物鞭毛运动对其在土壤中运移的影响。

对以上6种菌的粒径 （A）、形状系数 （B）、电位 （C）对吸附常数 （z1）、解吸常数 （z2）进行统计回归分析，假设它们之间的关系符合式 （4）、式（5）。

式中，D1，D2为未知常数；x1，x2，x3，y1， y2，y3为所探求的未知数。

对等式两边取以10为底的对数，则可转化为式（6）、式（7）。

根据概率论与数理统计学，运用多元线性回归方法、最小二乘法、回归系数检验方法求解，得到它们之间的关系为式 （8）、式 （9）。

从回归结果初步看到，吸附常数、解吸常数与微生物自身表面特性参数的一些关系规律。

（1）吸附常数与微生物的体积负相关；与微生物的形状系数、电位绝对值正相关。即当微生物体积较小、形状系数较大、电位绝对值较高时，土壤颗粒对其吸附能力强，从回归的幂次看，对吸附常数影响作用由大到小依次为电位、形状系数、粒径。

（2）解吸常数与微生物的体积负相关；与微生物的形状系数、电位绝对值正相关；即当微生物体积较小、形状系数较大、电位绝对值较高时，土壤颗粒对其解吸能力强，从回归的幂次看，对吸附常数影响作用由大到小依次为形状系数、电位、粒径。

（3）对比吸附和解吸回归结果可以看到，在吸附过程中电位是首要因素，而在解吸过程中形状系数的影响大于电位影响，成为主要因素。

（4）微生物的体积和形状系数对此过程的影响明显不同，且方向相反。

回归结果说明，微生物表面参数与吸附－解吸参数有密切关系，在进行理论解释的基础上建立数学关系，寻找某类微生物的通用迁移方程是可能的。

4 结 论

表1 不同微生物的物性及其吸附解吸常数

（1）对巨大芽孢杆菌在土壤中迁移的模型方程中重要参数进行了实验研究，得到其水动力弥散系数为3.2×10－6cm2／s，吸附常数为1.221×10－3，解吸常数为1.639×10－4，生长衰亡项系数为3.97×10－9。由于生长衰亡项系数比吸附解吸项系数小得多，则可忽略巨大芽孢杆菌的生长对其在土壤中运移的影响。对后续研究巨大芽孢杆菌降解菲的研究有重要意义。

（2）Freundlieh平衡吸附方程可以更好地描述巨大芽孢杆菌、大肠杆菌及微球菌在土壤中的吸附行为，线性平衡吸附方程可以更好地描述金黄色葡萄球菌在土壤中的吸附行为。Freundlieh平衡吸附方程和线性平衡吸附方程描述假单胞菌及枯草芽孢杆菌在土壤中的吸附行为相当。

（3）微生物体积越小，形状系数越大，电位绝对值越高，吸附常数和解吸常数越大。

（4）微生物自身物理性质对吸附影响能力由大到小依次为电位、形状系数、粒径，微生物自身物理性质对解吸影响能力由大到小依次为形状系数、电位、粒径。

［1］ 李桂花，李保国.大肠杆菌在饱和砂土中的运移及其模拟［J］.土壤学报，2003：783－786.

［2］Christine Stumpp，John R Lawrence，Jim Hendry M，et al.Transport and bacterial interactions of three bacterial strains in saturated column experiments［J］.Environmental Science and Technology，2011，45：2116－2123.

［3］Lian Jingyan，Liu Tianyu，Zhang Ruiling.Experimental investigation and numerical simulation for bacteria transport in soil［J］.Biotechnology and Bioengineering，2011，19（2）：327－333.

［4］ 张瑞玲，隋红，李洪，等.微生物在土壤中迁移物化参数的确定［J］.环境科学，2011：901－907.

［5］Anke Schafer，Petr Ustohal，Hauke Harms，et al.Transport of bacteria in unsaturated porous media［J］.Journal of Contaminant Hydrology，1998，33：149－169.

［6］Sim Y.Virus transport in unsaturated porous media［J］.Water Resources，2000，36（1）：173－179.