Notch1miRNA干扰质粒构建及功能鉴定＊

周学亮，万 力，刘季春

（南昌大学第一附属医院心脏外科，江西南昌330006）

Notch信号通路于90年前经摩根首次发现，其特点为该通路的受体Notch活性受糖基化、胞内运输差异和泛素化降解调控，而不依赖于第二信使的放大［1］。在多种生物的心脏发育期，Notch信号参与了心肌细胞分化、房室沟分界、瓣膜发育、流出道重塑、心室小梁形成等诸多过程［2-4］；心脏发育成熟后，Notch的作用可控制心血管系统对缺血缺氧损伤的反应，抑制心肌细胞纤维化，增强受损后心肌细胞活力［5-7］。本研究拟采用微小干扰核糖核酸（miRNA）技术，通过设计针对大鼠Notch1基因干扰序列，构建能在真核细胞中表达miRNA序列的载体，并转染H9c2心肌细胞，筛选干扰大鼠Notch1基因最佳的miRNA，为进一步观察Notch信号通路在心肌细胞的作用奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及菌株 H9c2心肌样细胞购自中科院上海生命科学院细胞库，Top10化学感受态细胞购自Invitrogen公司。

1.1.2 干扰质粒 BLOCK-iTTMPolⅡ miR RNAi Expres-sion Vector Kits购自Invitrogen公司。

1.1.3 主要试剂 T4DNA Ligase购自TaKaRa公司，质粒小提试剂盒购自OMEGA公司，LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司，RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所，兔Cleaved Notch1单克隆抗体购自abcam公司，小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG均购自北京中杉金桥公司，化学发光试剂盒（SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate）购自美国Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 干扰片段设计与合成 针对GeneBank中的大鼠Notchl基因编码序列（NCBI Reference Sequence：NM＿001105721.1），在Invitrogen网站分别在线设计3对pre-miRNA序列（表1），交Invitrogen公司合成，规格为2OD。

1.2.2 靶向Notch1miRNA干扰质粒的构建 将3对Oligonucleotide各自用TE Buffer溶解成200μmol／L，互补单链经退火形成双链，反应体系：200μmol／L Top Strand Oligonucle-otide 5μL，200μmol／L Bottom Strand Oligonucleotide 5μL，10×Oligo Annialing Buffer 2μL，dddH2O 8μL；退火条件：95℃，1min→85 ℃，1min→75 ℃，1min→65 ℃，1min→55℃，1min→45℃，1min→35℃，1min→25℃，1min→25℃，10min；形成的double strand Oligonucleotide分别用dddH2O稀释到100μmol／L。然后用载体构建试剂盒BLOCK-iTTMPolⅡmiR RNAi Expression Vector Kits进行重组克隆，将双链的miRNA Oligo利用T4DNA Ligase各自连接到miRNA表达载体pcDNATM6.2-GW／EmGFP-miR Vector中，以构建Notch1miRNA质粒。

表1 Notch1- 寡核苷酸序列

1.2.3 干扰质粒转化与测序分析 将3组连接产物转化Top10化学感受态细胞，接种于Spe＋（大观霉素）的Luria-Bertani（LB）培养基平板，次日随机挑选阳性单克隆菌落，于Spe＋LB液态琼脂培养基摇菌过夜，隔日小提质粒，送北京诺赛基因组研究中心有限公司基因测序，序列无误后分别命名为miRNA1281、miRNA4072、miRNA6637。

1.2.4 细胞培养及转染 Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium（DMEM）＋10%Fetal bovine serum（FBS）培养 H9c2心肌样细胞，铺12孔板，细胞生长至90%融合度时，按LipofectamineTM2000方法，分4组进行转染：Mock组（无效对照miRNA干扰质粒转染）、miRNA1281组（转染miRNA1281）、miRNA4072组 （转 染 miRNA4072）、miRNA6637 组 （转 染miRNA6637）。

1.2.5 靶向Notch1miRNA干扰质粒的筛选 4组H9c2心肌样细胞转染48h后，分别加90μL RIPA裂解细胞，4℃、12 000g离心提取总蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）测定蛋白水平。加等量十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液（2×），沸水煮10min各上样30μg，行8%SDS-PAGE蛋白电泳，湿转法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭后，分别用稀释的一抗［Cleaved Notch1（1∶500）、GAPDH（1∶200）］4℃孵育过夜，次日辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（1∶5 000）、山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）常温孵育1h，结束后采用增强化学发光法曝光，检测Notch1胞内结构域（N1ICD）的表达。

2 结 果

2.1 靶向Notch1miRNA干扰质粒成功构建 将双链的miRNA Oligo与pcDNATM6.2-GW／EmGFP-miR Vector各自连接后，转化Top10化学感受态细胞，小提质粒，送北京诺赛基因组研究中心有限公司基因测序，序列无误，见图1。

图1 靶向Notch1miRNA干扰质粒基因测序图

图2 荧光显微镜观察H9c2心肌样细胞Notch1miRNA的转染效率

2.2 靶向Notch1miRNA干扰质粒顺利筛选 利用LipofectamineTM2000将构建成功的miRNA1281、miRNA4072、miRNA6637干扰质粒转染H9c2心肌样细胞，荧光显微镜观察转染效率（图2），48h后提总蛋白，Western blot显示N1ICD在 Mock组、miRNA1281组、miRNA4072组、miRNA6637组表达逐渐降低，以miRNA6637组表达最低，约为Mock组的90%，说明3组miRNA均可靶向干扰Notch1基因，以miRNA6637效果最佳，根据沉默效果筛选理想的Notch1miRNA：Western blot检测H9c2心肌样细胞miRNA转染后N1ICD的表达（图3）；各组N1ICD灰度值比较见图4。

图3 H9c2心肌样细胞miRNA转染后N1ICD的表达

图4 各组N1ICD灰度值比较

3 讨 论

深入研究发现miRNA是一类存在于生物体内，长度约19～25个核苷酸的非编码小RNA，通过与mRNA的互补配对，使mRNA发生降解或翻译受抑，负性调控靶基因的表达［8-9］。在哺乳动物中，大约50%的蛋白受miRNA调控，研究显示miRNA几乎参与了迄今为止所有细胞之间的调控，在细胞发育、分化、凋亡、增殖中发挥重要作用，其表达的改变与人类多种疾病着密切相关［10］。目前研究表明miRNA对靶基因的干扰效果是小干扰RNA（siRNA）的10倍［11］。因此，采用miRNA干扰技术将会有更理想的干扰效应。本研究通过设计合成 miRNA，成功转入pcDNATM6.2-GW／EmGFP-miR Vector中，基因测序无误后，脂质体法瞬时转染H9c2心肌样细胞，荧光显微镜观察到各组miRNA转染效率约为80%左右，通过Western blot检验3组miRNA转染后N1ICD的表达差异，结果显示3组N1ICD表达均降低，以miRNA6637组最为明显，约为Mock组的90%，可见miRNA6637对Notch1的干扰效果最佳。

Notch配体在果蝇内为Serrate家族，在哺乳动物为Jagged／Delta家族，与配体结合后，Notch受体获得活性发生构象改变，经 TNF-α转化酶（TNF-αconverting enzyme，TACE）、γsecretase的二次裂解，形成NICD进入细胞核，与重组信号的免疫球蛋白结合蛋白Jκ（Recombination signal binding protein for immunoglobulin Jκ，RBP-Jκ）结合，启动多毛和分裂增强子1（Hairy and enhancer of split 1，Hes1）、多毛相关转录因子（Hairy-related transcription，HRT）等靶基因的转录［12］。有研究发现Notch1信号通路可刺激缺血心肌细胞增生，产生良好的心肌保护效应［13］。国内文献报道，应用Notch信号通路阻断剂-3，5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰-S苯基甘氨酸t-丁酯（DAPT）能抑制原代乳鼠心肌细胞增殖，促使心肌细胞发生凋亡［14］。最新研究发现，Notch1信号通路的激活可加快心肌梗死后期心功能的恢复，对于缺血性心脏病的治疗具有积极的临床意义［15］。本研究成功构建并顺利筛选靶向Notch1miRNA的有效干扰质粒，为Notch信号通路对缺血心肌细胞保护作用的机制研究奠定了实验基础。

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