DUSP9真核表达载体的构建及其在Hepa1-6肝细胞中的表达＊

杨 艳，向加林，欧阳旭红△，尹 玲，于国辉

（1.遵义医学院附属医院医学检验科，贵州遵义563000；2.遵义医学院医学检验系2006级本科，贵州遵义563003）

DUSP9基因是近年研究发现具有双重专一性的磷酸酶家族（Dual specificity protein phosphtases，DUSPs）成员之一。DUSPs可逆转应激通路中丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的活性，因此，也称作 MAPK磷酸 酶 家 族 （mitogen-activated protein kinase phosphatases，MKPs）。该家族属于酪氨酸蛋白磷酸酶超家族，可通过去磷酸化、钝化MAPK关键的酪氨酸和苏氨酸残基，调控MAPK的功能［1-2］。其家族成员因对MAPKs家族表现出独特的底物特异性，故分为DUSP1（又名 MKP1）、DUSP4（又名 MKP2）、DUSP6（又名 MKP3）、DUSP9（又名 MKP4）、DUSP10（又名MKP5）。研究发现，人源与小鼠DUSP9同源性为83%，在胎盘、肝、肾脏中高表达，且在发育进程中是可调型表达［3-4］，对胰岛素作用存在争议［2，5］，但其在胰岛素抵抗进程中的作用机制及分子靶点尚未清楚。本研究通过构建DUSP9真核表达载体，并在小鼠Hepa1-6肝细胞中过表达DUSP9，为进一步研究DUSP9生理功能及其在糖脂代谢、胰岛素抵抗进程中的作用奠定坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料 Hepa1-6肝细胞购自中科院上海细胞库；pEGFPN1载体购于GENECHEM公司；DH5α购于大连宝生物公司。主要试剂：DMEM高糖培养基、胎牛血清、Opti-MEM培养基购自GIBICO公司；LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；RNA提取试剂、DNA聚合酶PrimeSTARTMHS DNA Polymerase、dNTP Mixture、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ、Prime-ScriptTMRT reagent、引物、限制性内切酶、T4DNA ligase等购自TAKARA公司；去内毒素质粒小抽试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒均购自OMEGA公司；兔抗小鼠β-actin一抗、HRP标记的羊抗兔IgG二抗购自北京中杉金桥公司；兔抗鼠DUSP9购自Abnova公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的获取及扩增 以健康C57小鼠肝组织总RNA为模板，进行逆转录反应，反应条件为：37℃15min，85℃5s，将得到的cDNA溶液应用于PCR扩增。根据pubmed-GenBank中NM＿029352DUSP9mRNA序列，扩增小鼠DUSP9基因全编码区cDNA片段，所用引物即上游：5′-CCG GAA TTC TAT GGA GAG TCT GAG TCG G-3′（含ECORI酶切位点）；下游：5′-CGG GTA CCG GTA GTG TGG GGT CCA GCT CAA AG-3′（含 AgeI酶切位点），PCR扩增反应条件：98℃预变性4min；98℃变性12s，64℃退火17s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃加长延伸6min，并纯化PCR产物。

1.2.2 重组真核表达载体的构建 分别用ECORI和AgeI双酶切pEGFP-N1载体及目的基因片段并胶回收，T4DNA ligase 16℃连接过夜，第2天取10uL连接产物转化感受态细胞DH5α并将其涂布于含kanr的LB选择性平板进行筛选，挑取阳性单克隆，置于含kanr的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，质粒抽提，双酶切鉴定并送大连宝生物公司测序。

1.2.3 Hepa1-6肝细胞的培养及转染 （1）细胞培养：将 Hepa1-6肝细胞接种于6孔板，细胞密度确保第2天每孔能汇合80%，DMEM＋10%FBS培养（无双抗），CO2细胞培养箱（5%CO2，37℃）孵育细胞。（2）细胞分组及转染：将 Hepa1-6肝细胞分为3组，即阴性对照组（仅加入相对应量的脂质体和PBS的细胞，negative control group，NC组）、空载组（转染空载体pEGFP-N1的细胞，blank control group，BC组）、转染组（转染pEGFP-DUSP9的细胞，transfection group，TG组），每组设平行实验复孔（3孔），重复实验2次。将质粒和脂质体按1∶2.5与Opti-MEM混合进行转染，转染方法按LipofectamineTM2000说明书。

1.2.4 DUSP9mRNA表达水平的检测 转染48h后，分别提取各组细胞总RNA，逆转录合成cDNA。采用SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR法检测DUSP9mRNA的表达。以β-actin基因作为内参，用2-△△CT值表示基因相对表达量。所用引物即 DUSP9上游：5′-GCT TCA GTG GTC GTG CC G-3′，DUSP9下游5′-GGA GGG GAT GTG GTG TTC-3′；小鼠β-actin上游引物：5′-GCT GTC CCT GTA TGC CTC T-3′，下游：5′-GAT GTC ACG CAC GAT TTC C-3′。

1.2.5 DUSP9蛋白表达水平的检测 采用 Western blot法检测各组细胞DUSP9蛋白表达水平。提取各组细胞总蛋白，按每泳道加80ug蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，半干转至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）（0.45μm），室温封闭3h，一抗（内参β-actin 1∶250，DUSP9 1∶200稀释）4℃孵育过夜，二抗（1∶5 000稀释）孵育1h并洗脱，将PVDF膜置于化学发光板，加入发光试剂，室温反应2min后置化学发光成像系统成像。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行统计学分析，数据以±s表示，组间数据比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 pEGFP-DUSP9重组真核表达质粒酶切、测序鉴定结果

pEGFP-DUSP9质粒经ECORⅠ、AgeⅠ双酶切，切出约4 700、1 359bp的片段，分别代表质粒pEGFP-N1和插入目的片段DUSP9，与预期结果完全一致，说明DUSP9基因已正确克隆到pEGFP-N1表达载体。测序结果（部分见图1）显示与目的基因序列（NM＿029352）CDS区完全一致。

2.2 pEGFP-DUSP9转染的验证 倒置荧光显微镜下可见重组质粒转染Hepa1-6细胞发绿色荧光，见图2。

图1 重组质粒DNA测序结果部分彩图（红色划线部分表示克隆序列的起始位）

图2 Hepa1-6细胞培养及pEGFP-DUSP9转染图

2.3 DUSP9过表达的验证 RT-QPCR、Western blot检测结果显示，TG组肝细胞中，DUSP9mRNA表达量明显上调，是NC组61.82倍（ΔCt值：11.18±0.35 vs 17.13±0.22，P＜0.01），其蛋白水平也呈高表达，NC、BC组中DUSP9蛋白表达较低，提示DUSP9质粒成功转染Hepa1-6肝细胞且高表达，见图3。

图3 Western blot检测各实验组Hepa1-6细胞中DUSP9的表达

3 讨 论

胰岛素抵抗（IR）是2型糖尿病（T2DM）发病的一个关键因素，其产生是遗传和环境因素共同作用的结果。近年来随着国内外对IR的深入研究，氧化应激学说、炎症病因学说、内质网应激学说相继提出且成为IR的研究热点，其相关信号通路的调节子等研究更为深入。

MAPK及应激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinases，SAPK，）在IR发展进程中起着重要作用［6］，二者的作用靶点之一为胰岛素传导关键分子-胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate-1，IRS-1），均能使IRS-1丝氨酸残基磷酸化［7］，降低IRS-1酪氨酸磷酸化水平，进而阻碍了它与胰岛素信号传导系统下游元件的相互作用［8］，导致IR的发生。有趣的是MAPK及SAPK的激活是一个可逆的过程，阻断这些应激激酶可能阻止IR的发展。

DUSP9作为可逆转应激通路中MAPK活性的双重专一性磷酸酶家族成员，可钝化细胞外调节蛋白激酶（extracellularregulatedproteinkinases，ERK）及p38MAPK 的活性，但对SAPK的作用尚无定论，最新研究发现在恶性肾肿瘤透明细胞下调DUSP9的表达与疾病的预后不良有关联［9］。其在IR进程中的作用也尚未明确。有研究认为，在3T3-F442A脂肪细胞中过表达DUSP9，可封闭胰岛素诱导的脂质形成及糖摄取，负向调节胰岛素信号，可能促使了IR的发生［4］。然而，最新研究发现，在3T3-L1细胞中过表达DUSP9，抑制ERK及JNK／SAPK的磷酸化以及在较小程度上抑制了p38MAPK磷酸化［2］。茴香霉素诱导的IRS-1丝氨酸磷酸化被终止，IRS-1酪氨酸磷酸化的信号路径得以恢复，从而恢复了胰岛素的敏感性，并且能逆转肿瘤坏死因子-a（TNF-α）抑制的胰岛素信号。

此外，有研究发现在小鼠白色脂肪可检测到DUSP9的表达；肥胖小鼠体内DUSP9在胰岛素敏感组织特异性上调表达；3T3-F442A前脂肪细胞中DUSP9成低表达，在脂肪形成期表达上调［9］，说明DUSP9可能参与了促成熟脂肪细胞形成，或与脂质形成相关。但其在代谢组学如对糖脂代谢、脂肪细胞因子的作用尚未见进一步研究报道。

因此，本实验欲通过克隆DUSP9真核表达载体，并在胰岛素敏感组织-肝细胞（Hepa1-6）中过表达DUSP9蛋白，为进一步探讨DUSP9对糖脂代谢、脂肪细胞因子可能的作用及机制奠定研究基础。本实验中，利用pEGFP-N1质粒（带绿色荧光蛋白的报告载体）、采取双酶切定向克隆的方式（避免自连和反向连接）构建DUSP9重组真核表达载体。pEGFP-N1包含增强型绿色荧光蛋白基因EGFP，使得其在哺乳动物细胞中有较高的表达及较强的荧光得到最佳化，并为可应用流式细胞筛选或其他方式对瞬时转染哺乳动物细胞表达EGFP及目的蛋白的有效率提供一个依据；含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达；结构上，该质粒具有很强的复制能力，可以满足随宿主细胞分裂时跟随细胞质遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一；具有新霉素抗性（neo）基因，可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞。此外，采用含Kanr的LB选择性培养基筛选含Kanr转化子的质粒，并经双酶切初步鉴定克隆正确，最后经DNA测序分析确定所插入的目的基因片段的正确性。

本实验成功构建重组质粒pEGFP-DUSP9，并在Hepa1-6肝细胞中高效表达DUSP9蛋白，有望成为IR发生的分子生物学治疗靶点，同时也为T2DM的治疗提供新的思路。

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