5-氮-2′-脱氧胞苷对人膀胱癌细胞系T24细胞及其Apaf-1、APC基因甲基化状况的影响＊

王文卫，潘 俊，陈凌武，林焕懿，曾令友

（1.中山大学附属第一医院黄埔院区泌尿外科，广东广州510700；2.广东省中医院，广东广州510120；3.中山大学附属第一医院泌尿外科，广东广州510080）

有研究发现，在膀胱癌组织中人凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）及结肠腺瘤性息肉病（APC）基因的启动子区域存在高频率的异常甲基化，为进一步揭示Apaf-1及APC基因与膀胱癌的关系，本研究采用DNA甲基转移酶的抑制剂5-氮-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对膀胱癌细胞株T24进行处理，检测其Apaf-1及APC基因的甲基化表达，并分析肿瘤细胞的生物学行为改变，以探讨膀胱癌的发生机制并寻求新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 T24人膀胱癌细胞系购于中国科学院上海生物细胞研究所，5-Aza-CdR为Sigma产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 T24人膀胱癌细胞培养于含10%胎牛血清、100U／mL青霉素及100mg／mL链霉素的 RPMI1640培养基。在37℃、5%CO2饱和湿度条件下生长传代，实验时取对数生长期的细胞。

1.2.2 药物处理及分组 5-Aza-CdR按说明书配置溶液。实验分组：（1）阴性对照组；（2）实验组再分成4个组，即实验1组、实验2组、实验3组、实验4组，待细胞接种24h后，分别加入0.50、1.00、2.50、5.00μmol／L的5-Aza-CdR。

1.2.3 四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法测定5-Aza-CdR对细胞系增殖活性的影响 取对数生长期 台盼蓝检测活力大于95.00%的T24细胞，以104／孔密度接种于96孔细胞培养板，每孔体积200μL，细胞贴壁后以无血清培养基静止24h，各组均设3个复孔。置于37℃、5%CO2培养箱内培养，于72h进行处理，每孔加入MTT 20μL，37℃、5%CO2继续孵育4h，小心吸弃上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，充分混匀，于Bio-Tek酶标仪分析490nm处吸光度（OD）值。计算抑制率的公式为：抑制率（%）＝（1-实验组OD值÷对照组OD值）×100%。

1.2.4 流式细胞术（FCM）检测T24细胞周期及凋亡 细胞同期培养72h后用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰蛋白酶收集处理后的细胞，800r／min离心10min，沉淀采用300μL磷酸盐缓冲溶液（PBS）重悬，逐滴加入700μL预冷的无水乙醇中，乙醇终浓度为70.00%，4℃避光固定过夜。离心去上清液。PBS洗涤2次。重悬细胞于500μL含100unit／mL的RNaseA的PBS中，避光，37℃孵育30min。加2.00mg／mL碘化丙啶（PI）至终浓度50.00μg／mL，避光孵育30min。FCM检测细胞周期和凋亡率。

1.2.5 引物设计 Apaf-1的甲基化引物：5′-AGG AAA TTT AAA TTT TCG GGC-3′（F），5′-CGC GAA CGA AAC GTA ACT A-3′（R）；非甲基化引物：5′-GAG GAA ATT TAA ATT TTT GGG T-3′（F），5′-CCA CAA ACA AAA CAT AAC TA-3′（R）。APC的甲基化的引物：5′-TGT TTT ATT GCG GAG TGC-3′（F），5′-AAC CAC ATA TCG ATC ACG TAC-3′（R）；非甲基化引物：5′-TTG TGT TTT ATT GTG GAG TGT-3′（F），5′-AAC CAC ATA TCA ATC ACA TAC ACC-3′（R）。引物设计采用Primer premier 5.0引物设计专门软件，由Invitrogen公司鉴定合成。

1.2.6 甲基化特异性PCR方法（MSP法）检测膀胱癌T24细胞株中Apaf-1及APC基因的甲基化状态 取对数生长期的T24细胞，用0.25%胰酶消化处理，用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒按说明提取基因组DNA，提取的总DNA经紫外分光度计检验DNA的浓度和纯度。将2.00μg DNA加入1.50 mL EP管中并用DDW稀释至50μL，加5.50μL新鲜配制的3.00mmol／L NaOH，42℃水浴30min使DNA变性；加入新鲜配制的10.00mmol／L氢醌30μL及3.60mol／L亚硫酸氢钠520μL；50℃避光水浴16h。DNA经甲基化修饰处理后纯化、回收，-20℃保存。反应体系包括10×PCR缓冲液2.50 mL，dNTP 0.50μL，上、下游引物各1.00μL，DNA 1.00μL及2.50U／μL的TaqHS聚合酶0.40μL，加入ddH2O至终体积25.00μL。反应条件如下：94℃预变性3min、94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸5 min。PCR扩增产物进行2.50%琼脂糖凝胶电泳。结果判断标准：仅出现甲基化条带为高甲基化，同时出现甲基化和非甲基化条带为半甲基化，仅出现非甲基化条带为非甲基化，实验重复3次。

1.3 统计学处理 所有数据均由SPSS13.0统计软件处理，用±s表示，多样本比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 5-Aza-CdR对细胞增殖的影响 MTT实验可见5-Aza-CdR对T24细胞生长、增殖活性具有明显的抑制作用。0.50、1.00、2.50、5.00μmol／L 5-Aza-CdR作用 T24细胞72h后，细胞生长抑制率分别为0.50%、5.40%、20.40% 和23.00%，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），且呈明显的剂量依赖关系。

2.2 5-Aza-CdR对细胞周期及凋亡的影响 与对照组比较，在1.00 μ - - 作用下T24细胞G01期的细胞比例明显增加，S期细胞比例减少（P＜0.05），且随5-Aza-CdR浓度的增加，阻滞效果更为明显。实验组T24细胞凋亡增 加，5.00μmol／L 5-Aza-CdR 组 凋 亡 率 为 （40.35±3.63）%，与对照组（8.17±1.52）%比较，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 5-Aza-CdR对膀胱癌T24细胞周期和细胞凋亡的影响（±s）

表1 5-Aza-CdR对膀胱癌T24细胞周期和细胞凋亡的影响（±s）

＊：P＜0.05，与阴性对照组比较。

细胞周期（%）组别G0／G1 S G2／M凋亡率（%）阴性对照组71.30±1.15 25.53±0.25 3.13±1.36 8.17±1.52实验1组 67.13±0.74＊ 23.87±1.54 9.00±2.29＊ 15.70±2.72＊实验2组 71.60±1.40 19.40±1.32＊ 9.00±0.44＊ 24.83±3.14＊实验3组 73.80±1.50＊ 18.13±1.05＊ 8.03±0.40＊ 37.17±1.71＊实验4组 77.43±0.80＊ 15.20±0.61＊ 7.33±0.51＊ 40.35±3.63＊

2.3 膀胱癌T24细胞系中Apaf-1及APC基因甲基化状态MSP结果显示对照组细胞Apaf-1基因呈半甲基化状态，同时出现甲基化和非甲基化条带，APC基因仅出现甲基化条带，且呈高甲基化状态；而经5.00μmol／L 5-Aza-CdR处理后的Apaf-1及APC基因均呈去甲基化状态，见图1、2。

图1 不同浓度5-Aza-CdR处理T24细胞后Apaf-1基因甲基化检测结果

图2 不同浓度5-Aza-CdR处理T24细胞后APC基因甲基化检测结果

3 讨 论

近年来研究发现，以DNA甲基化为代表的表观遗传学改变在肿瘤的发生过程中起着重要作用，基因启动子区CpG岛高甲基化是导致许多基因去表达和基因印迹的重要途径［1-2］。Apaf-1及APC基因是近年来发现的重要的多重抑癌基因，Apaf-1是c-myc诱导肿瘤细胞凋亡中P53的下游成分，它参与线粒体介导的凋亡途径，细胞色素c／Apaf-1／caspase-9途径的激活依赖于 Apaf-1［3］。有研究表明，在多种恶性肿瘤中Apaf-1基因转录和翻译水平下调，而启动子甲基化是引起该基因“静默”的主要原因［4-6］。APC是Wnt信号的下游抑制因子，APC失活后则会导致β-catenin突变而与之解离，细胞质β-catenin转移到细胞核与Tcf-4结合，活化靶基因刺激肿瘤生长［7］。本课题的前期研究已证实Apaf-1、APC基因启动子区CpG岛高甲基化在膀胱癌发生、发展过程中所起的重要作用［8-9］。

本实验应用不同浓度的5-Aza-CdR作用于T24细胞系后检测细胞的增殖与凋亡，结果显示5-Aza-CdR可以明显抑制细胞增殖，诱导细胞周期阻滞和凋亡，细胞凋亡率明显提高。0.5μmol／L的5-Aza-CdR对T24细胞生长已有抑制作用，且随着药物浓度的增加，抑制作用逐渐增强，5.0μmol／L 5-Aza-CdR作用T24细胞72h后，细胞的生长抑制率达到23.0%。FCM检测结果显示5-Aza-CdR处理的T24细胞G0／G1期细胞明显增加，S期细胞减少，凋亡率达到（40.35±3.63）%。细胞凋亡受众多凋亡相关基因调控，具有两条独立的途径：死亡受体途径和线粒体介导的凋亡途径，抑癌基因的表达状况是癌细胞凋亡的重要调节因素。本研究发现在人膀胱癌T24细胞系中Apaf-1呈半甲基化状态，APC基因的启动子呈高甲基化状态，而5-Aza-CdR作用后的Apaf-1及APC基因均呈去甲基化状态。基因启动子高甲基化或半甲基化可导致基因表达沉默或降低，是肿瘤发生的早期事件，而DNA甲基化是由DNA甲基转移酶催化的，5-Aza-CdR抑制肿瘤细胞生长、诱导其凋亡的作用机制并非其本身的药物毒性直接所致，而是其去甲基化的间接作用［10］。5-Aza-CdR通过与DNA甲基转移酶共价结合，降低DNA甲基转移酶的生物活性，在DNA复制过程中可逆转基因CpG岛甲基化，调节基因表达，从而降低甲基化水平，因而被作为去甲基化制剂［11-12］。已经证实5-Aza-CdR在多种肿瘤中具有抑制细胞增殖和促凋亡作用［13-15］。本实验中发现，5-Aza-CdR能成功逆转两基因启动子的甲基化状态，使因甲基化失活的Apaf-1及APC基因去甲基化而重新表达的同时，膀胱癌细胞出现增殖受限，凋亡明显增加，这进一步说明了Apaf-1、APC基因表达上调可能是5-Aza-CdR诱导T24细胞凋亡和抑制细胞生长的重要机制之一。

通过本实验证实，5-Aza-CdR可在体外诱导膀胱癌细胞凋亡和抑制细胞增殖，提示表观遗传学调控可能成为膀胱癌治疗新的靶点。恶性肿瘤中因基因突变、缺失等遗传学改变导致的基因失活难以逆转，而启动子甲基化所致的基因沉默是可逆的，可通过相应药物逆转表遗传学的改变，恢复抑癌基因的功能，促进肿瘤细胞凋亡，达到治疗肿瘤的目的。目前，5-Aza-CdR已经用于白血病、骨髓增生异常综合征的临床治疗。因此，如能将5-Aza-CdR与其他干预药物联合用药，可能为膀胱癌的治疗提供了新的思路。

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