肺癌特异性靶向小分子多肽在肺腺癌放射治疗中的实验研究

李贵平 黄宝丹 杜 丽 韩彦江 黄 凯 刘 峰 郑文莉 张 辉 郭琳琅

1（南方医科大学南方医院 广州510515）2（南方医科大学珠江医院 广州510282）

肺癌特异性靶向小分子多肽在肺腺癌放射治疗中的实验研究

李贵平1黄宝丹1杜 丽1韩彦江1黄 凯1刘 峰1郑文莉1张 辉1郭琳琅2

1（南方医科大学南方医院 广州510515）
2（南方医科大学珠江医院 广州510282）

在固相合成小分子肽的过程中完成酪氨酸与cNGQGEQc的连接，采用氯胺-T法进行131I标记，构建肺腺癌NCI-H1975细胞株荷瘤裸鼠模型，随机分成4组，分别为：131I-cNGQGEQc治疗组、131I-cNAQAEQc治疗组、131I治疗组和生理盐水对照组，每组5只。尾静脉注射相应药物后，连续30天观测荷瘤裸鼠肿瘤移植物的大小，计算各组荷瘤裸鼠的肿瘤抑制率。研究结果表明：小分子多肽的131I标记率均大于90%，放化纯度均大于95%。131I-cNGQGEQc对肺腺癌NCI-H1975细胞移植瘤具有明显的抑制作用，治疗后第30天移植瘤肿瘤抑制率为60.93%。阴性多肽131I-cNAQAEQc治疗组的肿瘤抑制率为11.63%。131I治疗组的肿瘤抑制率为10.70%。实验结果表明，131I-cNGQGEQc对肺腺癌NCI-H1975细胞具有良好的亲和力及明显的靶向抑制作用，对非小细胞肺癌的靶向治疗具有潜在应用价值。

肺腺癌，放射治疗，肽类，碘放射性同位素，裸鼠

整合素是一类细胞膜表面糖蛋白受体家族分子，主要介导细胞与细胞之间及细胞与细胞外基质(ECM)之间的粘附[1]。它是由α和β两条链通过非共价键连接而成的异源性二聚体跨膜糖蛋白，是细胞粘附分子家族的重要成员。研究发现[2,3]，受体家族至少包括18个α亚单位和9个β亚单位，共同组成20余种不同的整合素，整合素信号转导通路在肿瘤生长、浸润及转移中的作用，为肿瘤的分子靶向治疗提供了重要依据。研究结果表明，整合素α3在正常组织中表达较低，但在非小细胞肺癌等肿瘤组织中却高表达[4]，整合素在肺癌细胞中的分布存在细胞特异性，这种特异性可作为识别非小细胞肺癌和小细胞肺癌细胞的标志物及作用靶分子。在成功筛选得到与肺腺癌发生特异性结合的小分子多肽cNGQGEQc基础上，进一步证实与癌细胞表面的整合素α3β1有高度特异性和亲和性，本文探讨以小分子多肽cNGQGEQc为载体，标记放射性核素131I，实现在荷瘤动物模型上对其在动物体内的肿瘤组织的聚集及抑瘤特性进行在体观察，评价其作为肺腺癌靶向放射治疗药物的可能性。

1 材料与方法

1.1材料

肺腺癌特异性靶向小分子多肽的氨基酸序列为cNGQGEQc，对照小分子多肽的氨基酸序列为cNAQAEQc，由苏州中科天马肽工程中心有限公司合成并纯化。氯胺-T：分析纯，由美国Sigma公司生产；Na131I溶液购自中核高通同位素股份有限公司。SN-684型放射免疫γ计数仪购自上海日环光电仪器有限公司。肺腺癌NCI-H1975细胞株购自中国科学院上海细胞库。5–6周龄、体重18–22 g/只BALB/c nu/nu裸鼠购自广东省实验动物中心(许可证号：SCXK粤2011-0015)。

1.2小分子多肽的131I标记

小分子多肽的131I标记通过在多肽N-端连接酪氨酸完成，小分子多肽cNGQGEQc及cNAQAEQc与酪氨酸偶联物制备方法、131I的标记方法及标记率的测定方法参见文献[5]。

1.3131I标记小分子多肽的纯化和放化纯度测定

131I标记小分子多肽采用Sep-Pak C18反相萃取柱进行纯化。首先活化C18柱，向柱内依次加入无水甲醇3 mL和生理盐水5 mL，将标记小分子多肽反应混合液全部移入C18柱内，取0.1%三氟乙酸生理盐水15 mL加入柱内洗去游离碘，最后取无水甲醇3 mL洗脱C18柱上的标记多肽，并收集每管1 mL，取10 μL测放射性计数，取标记峰产物作纸层析分析，计算放化纯度。

1.4131I标记小分子多肽的体外稳定性分析

取新鲜制备的131I标记小分子多肽100 μL与 1 mL新鲜人血清混匀，置于37°条件下温育2、4、6、8、20、24 h后，分别取样纸层析法测定其放化纯度，观察标记物的体外稳定性。

1.5荷瘤裸鼠模型的构建

取5–6周龄雄性裸鼠，SPF条件下饲养。常规方法培养肺腺癌NCI-H1975细胞至对数生长期，用0.25%的胰蛋白酶消化，离心除去消化液，加入无血清培养液制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×106/ mL，分别于裸鼠右后肢外侧皮下注射细胞悬液0.1 mL，建立肺腺癌细胞的荷瘤裸鼠模型，定期观察肿瘤生长情况，待裸鼠肿瘤直径长至0.8–1 cm左右时备用。

1.6标记小分子多肽在荷瘤裸鼠模型中的抑瘤作用

将20只接种肺腺癌NCI-H1975细胞后2–3周的荷瘤裸鼠随机分为4组，即131I-cNGQGEQc治疗组、131I-cNAQAEQc治疗组、131I治疗组和生理盐水对照组，每组5只。各组荷瘤裸鼠分别经尾静脉注射131I-cNGQGEQc (18.5 MBq，42 μg)、131I-cNAQAEQc (18.5 MBq，42 μg)、131I(18.5 MBq)和生理盐水(NS)，注射体积均为0.01 mL。给药前3 d至实验结束，在裸鼠饮水中加入适量质量分数l%碘化钾液，以封闭甲状腺。治疗期间观察各组荷瘤裸鼠的活动及进食情况，治疗开始后每3天用游标卡尺测量移肿瘤的长径(L)和短径(W)值。按照公式V(mm3) = (LW2π)/ 6计算肿瘤的体积，并计算肿瘤抑制率(IR)。IR = (V0−Vn)/V0×100%，公式中V0为生理盐水对照组肿瘤体积，Vn为治疗组肿瘤体积。治疗30 d后处死全部荷瘤裸鼠，分离肿瘤及裸鼠正常器官组织，称重后用体积分数10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片后行HE染色，作常规病理检查。

1.7统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件包进行数据处理，实验数据以x±SD表示，采用One-Way ANOVA分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1小分子多肽的131I标记率及放化纯度测定

在最佳标记条件下，131I-cNGQGEQc及131I-cNAQAEQc的标记率分别为(90.45±2.11)%和(90.27±2.10)%。经Sep-Pak C18反相萃取柱分离纯化后131I标记小分子多肽的放化纯度分别为(97.36±1.29)%和(96.73±1.35)%。

2.2131I标记小分子多肽的体外稳定性测定

在37ºC下人血清中放置2、4、6、8、20、24 h后，131I-cNGQGEQc的放化纯度分别为(95.07±1.10)%、(94.57±0.92)%、(94.00±0.72)%、(93.13±0.40)%、(92.17±0.59)%、(90.9±0.52)%；131I-cNAQAEQc的放化纯度分别为(95.23±0.81)%、(94.33±0.81)%、(92.93±0.29)%、(91.97±0.21)%、(91.17±0.31)%、(90.03±0.11)%。体外稳定性结果表明，131I标记小分子多肽具有良好的体外稳定性。

2.3131I标记小分子多肽在荷瘤裸鼠模型中的抑瘤作用

各组裸鼠在接种部位均有移植瘤形成，成瘤率为100%。各组荷瘤裸鼠移植瘤体积大小在开始治疗时差异无统计学意义(P＞0.05)。治疗开始后，各组荷瘤裸鼠移植瘤的体积均表现为随时间的延长而增大的趋势；但131I-cNGQGEQc治疗组与其他各组相比较，移植瘤体积的增长速度明显延缓(见图1)。

图1 荷肺腺癌裸鼠移植瘤治疗后肿瘤体积变化Fig.1 Volume changers of transplantation tumor by different treatments to lung adenocarcinoma-bearing mice.

治疗结束时，131I-cNGQGEQc治疗组与131I-cNAQAEQc治疗组、131I治疗组、NS对照组的肿瘤体积相比，差异有明显统计学意义(P＜0.01)；而131I-cNAQAEQc治疗组和131I治疗组与生理盐水对照组肿瘤体积差异则无统计学意义(P＞0.05)。与NS 对照组相比，131I-cNGQGEQc治疗组、131I-cNAQAEQc治疗组和131I治疗组的肿瘤抑制率分别为60.93%、11.63%和10.70%。

图2 各组移植肿瘤组织病理切片结果(×100)Fig.2 Pathological section of the transplantation tumor in each group(×100).

2.4荷瘤裸鼠移植瘤组织病理学结果

肺腺癌NCI-H1975细胞异体移植瘤的组织切片经常规HE染色、显微镜观察，131I-cNGQGEQc治疗组可见肿瘤组织坏死明显，胞核溶解，细胞结构消失。而131I-cNAQAEQc治疗组和131I治疗组则肿瘤细胞的形态、核分裂象和肿瘤细胞的排列方式等未见明显差异，组织病理切片结果如图2所示。

3 讨论

针对肿瘤发生发展的机制，从肿瘤细胞的特性、信号转导的途径以及肿瘤生长所需的环境因素等环节，寻找新的分子作用靶点，己成为抗肿瘤小分子多肽研究的热点。为了提高多肽药物对肿瘤细胞的杀伤作用，常将具有靶向作用的多肽与放射性核素相连接，用于体内放射靶向治疗。相对于大分子抗体，小分子多肽的优越性表现在可以有效避免大分子蛋白存在的穿透性差、清除缓慢、免疫源性等问题，且可有效与受体结合，标记方法和化学修饰简单易行，具有合成方便、制作成本低及可大批量生产的特性，可见核素标记小分子多肽较抗体具有更好的临床应用前景。近年来，与整合素αvβ3受体结合的小分子肽RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)在肿瘤分子影像学和放射靶向治疗研究中已成为热点之一[1,6,7]。

整合素是广泛存在于细胞表面的一类细胞粘附分子，介导细胞与细胞外基质间及细胞与细胞间的信息传递，在细胞间的粘附、增殖、分化和移动等方面发挥了重要作用，与包括肺癌在内的恶性肿瘤的发生发展密切相关[1–3]。采用基因芯片、基因表达限制性分析及流式细胞技术已经证实整合素α3β1在肺鳞癌和腺癌中存在表达异常，可作为非小细胞肺癌分子靶向治疗的靶点[4]。利用组合化学肽库筛选出能与肺腺癌细胞系特异性结合的小分子多肽cNGQGEQc，通过对其特异性和结构稳定性分析，证实小分子多肽的特异性和稳定性均较强；抗体阻断结合实验表明小分子多肽cNGQGEQc是通过细胞表面整合素α3β1与肺腺癌细胞发生特异性结合[8]。小分子多肽cNGQGEQc由8个氨基酸残基组成，分子量为837.89，两端的D型半胱氨酸通过二硫键形成环肽，环肽结构有助于提高小分子肽的稳定性，减少降解的机会。对肽的活性结构分析表明，-NGXG-结构中的3个氨基酸对小分子多肽的粘附至关重要，而且小分子多肽的长度cNGQGEQc也与细胞粘附活性密切相关[8]。本实验选择整合素作为肺腺癌的分子靶点，以特异性识别整合素α3β1的小分子多肽cNGQGEQc作为放射性核素131I的载体，在荷肺腺癌裸鼠模型中进行小分子多肽的实验性靶向放射治疗研究。在固相合成小分子多肽的过程中直接完成cNGQGEQc与酪氨酸(Tyr)的连接，通过氯胺-T法进行131I对cNGQGEQc的放射性标记，标记方法简单、标记效率高、体外稳定性好，可进一步应用于肿瘤治疗的研究。

考虑到放射性核素示踪技术具有安全、可靠和无创性以及治疗放射性核素131I发射的β射线通过电离辐射生物效应可达到抑制或杀伤肿瘤细胞的特点，本文对131I标记的cNGQGEQc在荷肺腺癌裸鼠移植瘤中的治疗效果进行研究，结果表明：经单次尾静脉注射放射性活度18.5 MBq，131I-cNGQGEQc治疗组移植瘤肿瘤抑制率为60.93%；而阴性多肽131I-cNAQAEQc治疗组及131I治疗组的移植瘤肿瘤抑制率分别为11.63%和10.70%；提示131I-cNGQGEQc对肺腺癌NCI-H1975细胞移植瘤具有明显的靶向抑制作用。本实验中放射性药物的给药途径为单次静脉给药，如能多次给药则可获得更好的治疗效果。而且实验中每只荷瘤裸鼠经尾静脉注射的放射性活度为18.5 MBq[5]，下一步将继续优化投入的剂量以取得最佳的治疗效果。本文实验研究结果为进一步开展基于小分子多肽的特异性放射靶向诊断和治疗肺癌的临床研究提供依据。

1 Caccavari F, Valdembri D, Sandri C, et al. Integrin signaling and lung cancer[J]. Cell Adhesion & Migration, 2010, 4(1): 124–129

2 Desgrosellier J S, Cheresh D A. Integrins in cancer: biological implications and therapeutic opportunities[J]. Nature Reviews Cancer, 2010, 10(1): 9–22

3 Desgrosellier J S, Barnes L A, Shields D J, et al. Integrin αvβ3/c-src “oncogenic unit” promotes anchorageindependence and tumor progression[J]. Nature Medicine, 2009, 15(10): 1163–1169

4 Guo L, Zhang F, Cai Y, et al. Expression profiling of integrins in lung cancer cells[J]. Pathololy-Research Practice, 2009, 205(12): 847–853

5 李贵平, 黄宝丹, 郑文莉, 等. 肺癌特异性靶向多肽的131I标记及其对小鼠的急性毒性试验[J]. 放射免疫学杂志, 2012, 25(5): 487–489

LI Guiping, HUANG Baodan, ZHENG Wenli, et al. Radiolabeling of polypeptide for specific targeting lung cancer and its acute toxicity in normal mice[J]. Journal of Radioimmunology, 2012, 25(5): 487–489

6 李贵平, 张辉, 池晓华, 等. 多肽受体介导的放射性核素靶向治疗的研究进展[J]. 放射免疫学杂志, 2010, 23(3): 308–312

LI Guiping, ZHANG Hui, CHI Xiaohua, et al. Research progress of targeted radionuclide therapy mediated by polypeptide receptor[J]. Journal of Radioimmunology, 2010, 23(3): 308–312

7 崔永刚, 张春丽, 王荣福, 等.131I-cRGD环肽对荷黑色素瘤小鼠的靶向治疗作用[J]. 中华核医学杂志, 2009, 29(2): 92–95

CUI Yonggang, ZHANG Chunli, WANG Rongfu, et al. An experimental study on targeted therapy of radioiodinated cyclic cRGD peptide on melanoma bearing mice[J]. Chinese of Journal Nuclear Medicine, 2009, 29(2): 92–95

8 郭琳琅, 郭颖, Derick Lau. 一种特异性识别非小细胞肺癌A549细胞的小分子肽[J]. 生物化学与生物物理进展, 2007, 34(10): 1080–1085

GUO Linlang, GUO Ying, Derick Lau. Anovel specific small molecule peptide for non-small cell lung cancer cell A549[J]. Progress in Biochemistry and Biophysics, 2007, 34(10): 1080–1085

CLCTL99

Experimental study of radiotargeting-therapy with small molecular polypeptide in nude mice bearing lung adenocarcinoma

LI Guiping1HUANG Baodan1DU Li1HAN Yanjiang1HUANG Kai1LIU Feng1ZHENG Wenli1ZHANG Hui1GUO Linlang2

1(Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou510515,China)
2(Zhujiang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou510282,China)

Background:Integrin signal transduction pathways provide an important basis for molecular targeting therapy of cancerin tumor growth, infiltration and transfer. Existing research data have shown that small molecular peptide labeled with radionuclide has good clinical application prospects, but the successful researches on lung cancer have not been reported so far. It is considered that the main reason is the lack of small molecule peptide for specific targeting lung cancer. Purpose: Based on the small molecular peptide cNGQGEQc for specifically identifying integrin α3 and β1 found previously, polypeptide cNGQGEQc is selected and radiolabelled with131I. And the inhibitory effect of131I-cNGQGEQc in nude mice bearing lung adenocarcinoma is observed. Methods: The coupling of cNGQGEQc and tyrosine was done in the processing of solid phase synthesis of small molecular peptide. Chloramine-T method was used for radiolabelling of cNGQGEQc with131I. Twenty nude mice bearing NCI-H1975 were built and randomly divided into four groups with five mice in each group, including the group of131I-cNGQGEQc, the group of131I-cNAQAEQc, the group of131I and the saline control group. The general condition was observed in nude mice bearing tumor after tail vein injection of corresponding drugs. And the tumor sizes after grafting were measured per 3 days in 30 days. The inhibitory rate of tumor in each group was calculated. Results: The labeling efficiencies of131I-cNGQGEQc and131I-cNAQAEQc were greater than 90% with the radiochemical purity of more than 95%, and131I-cNGQGEQc had obvious inhibitory effect for transplantation tumor in nude mice bearing NCI-H1975 adenocarcinoma of lung. After a treatment for 30 days the tumor inhibitory rates were 60.93% for the group of131I-cNGQGEQc, 11.63% for the group of131I-cNAQAEQ and 10.70% for the group of131I. Conclusion:131I-cNGQGEQc has a good affinity and effective inhibit effect for the NCI-H1975 lung adenocarcinoma. Integrin is a promising targeting therapy agent for non-small cell lung cancer.

Lung adenocarcinoma, Radiotherapy, Peptides, Iodine radioisotopes, Mice nude

TL99

10.11889/j.0253-3219.2013.hjs.36.060301

广东省科技计划项目(2012B031800391)和南方医院院长基金项目(2012Z008)资助

李贵平，男，1962年出生，1999年于上海第二医科大学获博士学位，中国科学院上海应用物理研究所博士后，主任医师，从事分子

影像学和肿瘤核医学的研究

2013-03-26，

2013-04-18