维生素C对大鼠肾小管上皮细胞增殖活力的影响

陈 昕，赵 雷，周余来

肾脏疾病在临床具有较高的发病率，近些年来，随着相关医疗技术的发展，许多疾病得到了有效控制，但是，肾衰竭等肾脏疾病尚未得到有效治疗，相关的死亡率也没有得到明显的改善，部分慢性疾病常反复发作，迁延不愈，其发病率甚至有逐年增高的趋势［1，2］。

目前，部分研究表明，肾小管细胞的损伤，是多种肾疾病的最终促成因素［3－5］。因此，本实验旨在优化大鼠肾小管上皮细胞的培养方法，为肾脏疾病的体外研究提供一定的技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级 Wistar大鼠，雌性，体重80－110 g，由吉林大学白求恩医学院动物中心提供，动物许可证号：SCXK－（吉）2007－0003。

1.2 试剂及仪器 DMEM／F12培养基及胎牛血清购自Gibco公司，II型胶原酶购自Sigma公司，Percoll分离液购自Pharmacia公司，兔抗大鼠CK－18 IgG单克隆抗体购自北京博鳌森生物技术有限公司，FITC－羊抗兔IgG多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，羊抗兔IgG SABC试剂盒及浓缩型DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，CCK－8试剂盒购自碧云天生物技术研究所。IX－70倒置相差显微镜及正置生物学显微镜均购自日本Olympus公司，FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司。

1.3 大鼠肾小管上皮细胞的分离培养 断颈处死大鼠，用75%酒精进行全身消毒，开腹取出肾脏，去除肾包膜后，弃去髓质，剪碎皮质后，用PBS反复冲洗，洗净残余血液成分。用0.1%的Ⅱ型胶原酶，于37℃震荡消化20 min，收集消化液，并用适量PBS溶液洗涤残余组织块2次，收集清洗液，消化液和清洗液经80目筛网过滤后，1 800 rpm离心5 min收集沉淀。沉淀经PBS清洗2－3次后，用DMEM／F12培养基悬起，用45%Percoll分离液进行梯度分离，3 000 rpm离心20 min，进一步分离纯化肾小管节段［6］。将肾小管节段接种在培养皿内，用含10%胎牛血清的DMEM／F12培养基，于37℃、5%CO2条件下，对肾小管节段进行贴壁培养，2－3天换液一次。

1.4 大鼠肾小管上皮细胞的观察和鉴定 在肾小管节段贴壁后，于倒置相差显微镜下观察肾小管上皮细胞的生长状态，记其生长特征；待肾小管上皮细胞从肾小管组织周围爬出后，对细胞进行CK－18的免疫组化染色，免疫组化染色过程按SABC和DAB试剂盒操作说明进行，染色结果于正置生物学显微镜下进行观察；同时，用流式细胞仪检测细胞CK－18的表达情况。

1.5 维生素C对大鼠肾小管上皮细胞增殖活力的影响 将肾小管上皮细胞以1×103cells／well的量种于96孔板中，每孔终体积为100μl，用含10%胎牛血清的DMEM／F12培养基进行培养，分别在接种后的第0天、第1天和第2天，用CCK－8方法检测细胞的增殖情况，具体操作方法按CCK－8试剂盒操作说明进行。用此方法对P2、P3代细胞的增殖活力进行初步分析，并检测在加入不同剂量（10 mg／L、30 mg／L和100 mg／L）维生素C后，P3代细胞的增殖变化情况。

2 结果

2.1 大鼠肾小管上皮细胞的形态观察和鉴定结果

大鼠肾小管节段在贴壁12 h后，可见小管节段形状明显改变，培养24 h后，上皮细胞开始从组织内爬出，细胞呈铺路石样生长（图1）。细胞在培养一周左右可进行首次传代。

流式细胞仪分析结果显示：用本实验方法分离的肾小管上皮细胞，CK－18的表达效率在90%以上，肾小管上皮细胞具备一定的纯度（图2）。免疫组化染色结果显示：肾小管上皮细胞的CK18表达呈阳性，阳性率在90%以上，且CK－18主要集中在细胞质中表达（图3）。

2.2 维生素C对大鼠肾小管上皮细胞增殖活力的影响

由图4可见：正常培养的P2代细胞具备一定增殖能力，随着培养时间的延长，细胞数目逐渐增加；

图1 肾小管上皮细胞的镜下观察形态

图2 CK－18的流式细胞仪检测结果

图3 肾小管上皮细胞的CK－18免疫组化染色结果（×200）

而P3代细胞增殖活性明显下降，细胞在培养一段时间后不再继续生长，甚至逐渐出现凋亡现象，细胞总体数下降。在维生素C的作用下，P3代细胞可以维持一定的增殖活力，培养时间适度延长（P＜0.05），但是，各剂量之间没有明显统计学差别（P＞0.05），如图5所示。

图4 肾小管上皮细胞的增殖活力分析结果

图5 肾小管上皮细胞的增殖活力分析结果

3 讨论

随着细胞工程和基因工程技术的发展，国内外陆续诞生了多种不同种属的肾小管细胞株，如：人HK－2细胞株、大鼠NRK－52EA细胞株等。这些细胞株在建系过程中的转基因等永生化技术，可能会导致细胞与在体动物模型存在一定的差异，进而对某些研究会产生影响［7，8］。而原代培养的肾小管上皮细胞，尽管在传代、培养方面较为不便，但细胞自身生物学特性与在体细胞更为相似，因此，优化肾小管上皮细胞体外培养方法，对一些体外实验来说仍具有着较为重要的价值［6，9，10］。

本研究所用方法经济简便，可用简易方法适度提高肾小管上皮细胞的生命活性，延长培养时间。但是，本方法仍不能提高细胞的传代次数，在维生素C存在的条件下，P4代细胞仍不能正常生长，也不能长期培养，仅前3代细胞可供体外分析实验使用，因此，如何能在维持细胞自身特性的前提下，进一步延长肾小管上皮细胞的传代次数，仍需进一步的探索和研究。

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