杨绍娟,薄立华,吴晓冬*
(吉林大学中日联谊医院1.病理科;2.中心研究室,吉林 长春 130033)
介入干预包括动脉灌注与动脉栓塞是原发性肺癌综合性干预的重要措施之一[1],但肺癌细胞的多药耐药性严重制约了介入干预的远期疗效。为了解原发性肺癌耐药基因的表达与不同介入干预方法的关系,本文对未行化疗而经支气管镜活检和手术的肺癌标本行介入干预后经支气管镜活检和手术的肺癌标本,应用免疫组化方法检测癌细胞中耐药基因的表达情况,利用具有高分辨能力和精确定量特征的流式细胞术研究肺癌细胞PgP、GSTπ蛋白表达在肺癌早期耐药发生中的作用以及与细胞周期的关系,并探讨其临床意义[2,3]。
1.1 病例来源 选择我院2008年10月至2011年5月经支气管镜活检和手术切除的肺癌标本(包括肺鳞癌、腺癌、小细胞癌)97例。其中男54例,女43例,年龄36~65岁。
1.2 病例分组 根据支气管镜活检和手术前有无实施化疗分为非化疗组(36例)和介入治疗组(61例)。同时,介入干预组根据是否加行动脉栓塞再分为非栓塞组与栓塞组。
1.3 介入方法 常规经皮股动脉穿刺插管,行支气管动脉造影,了解肿瘤供血情况,选择性和超选择性供血动脉插管。根据是否应用碘油抗癌药乳剂栓塞支气管动脉分为非栓塞组与栓塞组。非栓塞组(33例):单纯行动脉灌注化疗药物卡铂(CBP)或顺铂(DDP)、丝裂霉素(MMC)、5-氟尿嘧啶(5 Fu)等,干预2~3次。栓塞组(28例):将导管插入相应支气管动脉,常规灌注化疗药物,随后用超液态碘油10ml加DDP 40mg、MMC10mg及非离子型对比剂(优维显300)5ml反复推抽(泵法)制成乳剂,在X线监视下经导管缓慢注入,干预1~3次。
1.4 免疫组化方法 石蜡组织标本切片,脱蜡至水化,所用一抗为福州迈新公司鼠抗人P糖蛋白(PgP)和谷胱甘肽硫转移酶π(GSTπ)抗体,二抗为通用型免疫球蛋白G(Ig G)辣根过氧化物酶多聚体,二氨基联苯胺显色后复染,封片。阳性结果判断:PgP、GSTπ阳性结果为在细胞浆或(和)细胞膜上出现棕色颗粒,随机观察200个细胞,根据阳性细胞数和染色强度分级,<5%为阴性,阳性标本每增加25%为一级[3]。
1.5 免疫荧光染色及检测 分别加入特异性第一抗体即抗PgP、GSTπ蛋白单抗37℃恒温水浴孵育30 min,PBS离心洗涤2次,去尽上清液体,加入FITC标记的二抗,在37℃水浴30 min,PBS离心洗涤2次以除去未结合的多余抗体。200目钢筛过滤。检测时设阴性对照(以PBS代替一抗),在流式细胞仪上检测FITC在受488 nm氩离子激光激发的荧光强度,得出细胞群体在各时相PgP、GSTπ蛋白的表达率。
1.6 统计学分析 统计均经r×2形式及χ2值分割方法处理。
2.1 免疫组化检测 97例肺癌病例中,33例非栓塞组PgP与GSTπ阳性表达率(21例63.6%、23例69.7%)明显高于36例非化疗组(16例44.4%、15例41.7%),P 值均<0.01;非栓塞组PgP与 GSTπ阳性表达率明显高于28例栓塞组(14例50.0%、13例46.4%),P值均<0.01;栓塞组PgP与 GSTπ阳性表达率与非化疗组比较无明显差异,P>0.05(见表1)。
2.2 FITC荧光强度间接反映细胞膜PgP、GSTπ蛋白表达率 由表2可见,非栓塞组PgP、GSTπ蛋白表达明显高于非化疗组、栓塞组,P值均<0.01;栓塞组PgP、GSTπ蛋白表达与非化疗组相比无明显差异,P>0.05。
表1 各组的PgP、GSTπ阳性表达比较
表2 流式细胞术双参数标记检测各干预组中的PgP、GSTπ蛋白(x—±s)干预方法 n PgP表达率(%)GSTπ表达率(%)非栓塞组15 6.07±1.36 2.46±0.28栓塞组 15 3.05±1.07 1.21±0.14非化疗组10 2.78±1.13 1.08±0.09
原发性肺癌是危害人类生命的重要疾病之一,采用介入疗法是干预原发性肺癌的重要手段,而肿瘤细胞在各种化疗药物环境中仍能不同程度地继续存活与生长,这就限制了介入治疗的远期疗效。肿瘤细胞耐药的生物学基础取决于本身细胞的多药耐药基因(MDR)。现已证实人类组织中的MDR有2种亚型,MDR1在肿瘤生成过程中可表达增高,产生多药耐药性;而MDR2经研究证实与肿瘤细胞的耐药性无关[4]。MDR1表型的标志是一种跨膜糖蛋白,称为PgP,将有毒的亲脂性药物逆着梯度转运到细胞膜外,以降低毒性药物在细胞内的聚集[5],从而导致化疗的失败。PgP的过度表达与多种肿瘤的耐药有关[6,7]。GSTπ是谷胱甘肽硫转移酶(GST)的亚型之一,主要催化还原性谷胱甘肽与亲电性物质间的反应,对生物细胞起保护作用,参与MDR的耐药发生。经研究发现GSTπ在许多肿瘤中表达均升高,而在正常组织表达率很低,它可能成为某些肿瘤(肺癌、胃肠癌、宫颈癌等)的标志酶,对肿瘤的早期诊断有重要意义[8]。
本研究表明,多药耐药阳性表达在介入栓塞组与非化疗组无显著性差异,非栓塞组采用单纯动脉灌注化疗法,使多药耐药性阳性表达明显升高,证明介入化疗栓塞干预抑制肿瘤细胞耐药性产生的效果明显优于单纯动脉灌注化疗[9]。这可能与选用的超液态碘油抗癌药乳剂作为栓塞剂有关,其可选择性进入瘤体内,闭塞肿瘤血管,并可进入肺组织的毛细血管床,达到支气管动脉和肺动脉双重栓塞的目的,在瘤体内碘油与抗癌药缓慢分离局部药物浓度高,作用持久;但关于化疗栓塞影响耐药的详细机制有待于进一步研究。本研究证明,检测癌组织中的PgP与GSTπ对肺癌的化疗有重要的指导意义,鉴于支气管动脉灌注化疗可使肺癌中多药耐药性的阳性表达增高,而化疗栓塞支气管动脉对癌细胞耐药性产生的诱导性较小,因而,在行介入疗法干预肺癌时,应提倡精细操作,在化疗方案个体化的基础上,对肺癌的介入干预应尽可能选择化疗栓塞,并联合应用耐药逆转调节剂,以提高疗效。
临床耐药的表型存在差异,临床肺癌、肝癌等存在内源性耐药,且耐药倍数很低,个体耐药差异很大[10]。因此,充分利用免疫技术检测耐药基因的蛋白表达将为临床肺癌多药耐药的研究提供很好的手段。
[1]邱春丽,赵文轩,代引海,等.支气管动脉介入灌注栓塞治疗中晚期肺癌疗效分析[J].当代医学,2010,17:320.
[2]Shinohara N,Liebert M,Wedemeyer G,et al.Evaluation of multiple drug resistance in human bladder cancer cell lines[J].J Urol,1993,150:505.
[3]Pujol JL,Simony J,Gautier V,et al.Immunohisto chemical study of Pglycoprotein distribution in lung cancer[J].Lung Cancer,1993,10:1.
[4]Lau A,Nightingale S,Taylor GP,et al.Enhanceed MDR1 gene expression in human T-cell leukaemia virus I infected patients offers new propects for therapy[J].Blood,1998,91:2467.
[5]潘启超,胥 彬,编著.肿瘤药理学与化学治疗学[M].郑州:河南医科大学出版社,2000:396-399.
[6]Sharp SY,Smith V,Hobbs S,et al.Lack of a role for MRP1 in platinum drug resistance in human ovarian cancer cell lines[J].Br J Cancer,1998,78:175.
[7]Britten RA,Green JA,Warenius HM.Celluar glutathione(GSH)and glutathione s-transferase (GST)activity in human ovarian tumor biopsies following exposure to alkylating agents[J].Int J Radiat Oncol Biol phys,1992,24:527.
[8]李之山,张汝刚,罗贤懋,等.谷胱甘肽硫转移酶π在人食管鳞癌的表达[J].中华肿瘤杂志,2001,23:39.
[9]孙 钢,金 鹏,谢宗贵,等.介入治疗对耐药基因在原发性肺癌表达的影响[J].中华放射学杂志,2002,36:806.
[10]徐 萌,李金瀚,等肺癌耐药发生和细胞周期改变的流式细胞术分析[J].中华肿瘤杂志,2000,22(5):385.