龟板促MSCs 肝脏归巢在大鼠肝损伤后修复中的作用研究

韩克强，李 靖，梁 平，郑 璐，黄小兵 (第三军医大学新桥医院肝胆外科，重庆400037)

在中医临床中，龟板对促进肝脏再生、修复均有明显的治疗效果，同时在多种治疗肝病的中药方剂中龟板也均是重要的组成部分。但龟板对肝损伤后的抗纤维化和肝功能修复是否有益处，目前尚不清楚。既往研究提示，骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在损伤肝脏结构和功能修复中均发挥重要作用，参与肝脏损伤后的抗纤维化和解毒功能修复等过程［1］。我们前期的研究发现，龟板饲养可促进MSCs向肝脏定植。因此，本研究拟通过CCl4肝损伤模型研究龟板饲养对大鼠肝脏功能修复和抗纤维化的作用，旨在为肝损伤修复的研究提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 骨髓间充质干细胞培养、标记及移植

按文献［2］方法培养原代MSCs。颈椎脱臼法处死大鼠，取股骨，PBS 吹吸骨髓，DMEM-L 培养基稀释。2 500 r/min 密度梯度离心后收集单个核细胞，PBS 洗涤去除分离液后接种于24孔板内。培养条件:DMEM-L(含 10% FBS)培养基，在 5%CO2，37 ℃饱和湿度。细胞贴壁生长，待90%融合时，2.5 g/L胰蛋白酶消化，DMEM-L 重悬，按1 ×104cm-3传代培养，收集第3 ～4 代 MSCs 备用。腺病毒(携带绿色荧光蛋白)转染MSCs，扩增培养后消化、收集，PBS 重悬后制成单细胞悬液，取MSCs 悬液1 mL(含细胞数约1 ×106)，经大鼠尾静脉注射移植，移植 MSCs 均每2 d 注射1 次。

1.2 实验动物准备及分组

6 ～8 周龄雄性 SD 大鼠，体质量 200 ～250 g(均购自第三军医大学实验动物中心)。选择常见的CCl4肝损伤动物模型为细胞移植受体。2%CCl4按照2.5 mL/kg 灌胃，每日1 次，连续3 d，正常对照组相同剂量的生理盐水灌胃。肝损伤模型建立后，根据是否服用龟板水煎液分为龟板组和普食组，2 组均常规饲养，龟板组每天给予龟板口服液4 mL，分上午和下午2 次灌胃1 周;普食组则给予等体积蒸馏水灌胃。其中龟板口服液采用水煎法制备。制备含龟板生药量1 kg/L 的水煎液，根据成人日服药量10 倍折算成大鼠灌胃剂量，合4 g/kg，灌前稀释成4 mL。

1.3 Western blot 检测 HGF 蛋白

组织总蛋白提取:脱颈处死动物，取各组肝脏组织100 mg。加入1 mL 冰预冷的蛋白提取液和10 μl PMSF，然后在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆。将样品转入1.5 mL 4 ℃的 EP 管中，20 000 × g 离心15 min，收集上清。取其中少量测蛋白浓度(BCA 法)，其余分装冻存。取等量预处理的蛋白样品上样，恒压60 V 对其进行SDS-PAGE 电泳，电转至PVDF 膜，5%脱脂奶粉-PBST 室温封闭1 h 后，加入羊抗大鼠 HGF 抗体(1∶1 000)、羊抗大鼠 GAPDH(1∶1 000)、4 ℃孵育过夜，再与 HRP 标记的兔抗羊IgG 37 ℃孵育1 h，按ECL 发光试剂盒说明书操作，凝胶成像仪(美国 Bio-Rad 公司)曝光、照相。目的蛋白量以GAPDH 相对量表示。

1.4 激光共聚焦检测肝脏MSCs 含量

取肝脏组织，做冰冻切片，4%多聚甲醛固定后PBS 洗涤3次，封片。移植MSCs 中均转染表达GFP 的腺病毒，因此，激光共聚焦显微镜下计数发绿色荧光细胞即为移植MSCs。计数方法:每张切片随机选10 个视野，计数各个视野MSCs 个数后取平均值。

1.5 肝脏纤维化及功能指标检测

取肝脏组织，10%福尔马林溶液固定过夜，石蜡包埋后按5 μm厚连续切片。切片脱蜡至水，取0.1 g 天狼星红(美国santa 公司)溶于100 mL 苦味酸饱和液中，苦味酸天狼星红染液浸染1 h，PBS 冲洗，苏木素染核。封片后在偏振光显微镜下随机观察10 个视野，以Photoshop 软件的Histogram 功能分析各组织内Ⅰ型胶原所占面积的百分数。肝组织Hyp 是由胶原和弹性蛋白水解所得的一种氨基酸，约占胶原重量的14% ，其他蛋白质中罕见，Hyp 含量随着肝纤维化加重而增多。采用胃酶酸解法检测肝组织Hyp［3］，根据测得的A560 和标准曲线计算出每克肝组织的Hyp 的含量。腹主动脉取血，分离血清，全自动生化分析仪检测血清白蛋白、谷丙转氨酶(ALT)水平。

1.6 统计学方法

使用SPSS 13.0 软件进行数据的统计分析，以均数±标准差(±s)描述定量资料。2 组间比较采用t 检验，3 组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 龟板对肝损伤大鼠肝脏修复的影响

大鼠肝损伤模型建立后，分别观察普食及龟板饲养0 d、7 d、14 d 及 28 d 的肝脏 I 型胶原面积百分比、Hyp 含量，及血清白蛋白、ALT 水平(图1)。肝损伤模型建立后(0 d)，2 组肝脏Ⅰ型胶原面积百分比、Hyp含量，及血清白蛋白、ALT水平均无

图1 2 组CCl4 肝损伤后肝纤维化及修复相关指标比较(n=6)统计学差异。14 d 及28 d 时，与普食组相比，龟板组肝脏Ⅰ型胶原面积百分比、Hyp 含量及ALT 水平明显降低，血清白蛋白水平明显增高，差异有统计学意义(P ＜0.05)。

2.2 龟板对肝损伤大鼠肝脏HGF 蛋白表达的影响

Western blot 检测正常及CCl4损伤大鼠肝脏组织HGF 蛋白。正常组普食喂养(0.35 ±0.03)，正常组龟板喂养(0.58 ±0.04)，损伤组普食喂养(0.62 ±0.04)，损伤组龟板喂养(0.76±0.03)，与正常组相比，无论普食或龟板喂养，肝损伤大鼠肝脏HGF 蛋白表达明显增加;与普食喂养组相比，无论正常或肝损伤大鼠，龟板喂养明显增高肝脏HGF 蛋白表达，差异均有统计学意义(P ＜0.05)。

2.3 龟板对移植MSCs 向肝损伤大鼠肝脏定植的影响

激光共聚焦法检测定植于肝脏组织MSCs 数量。每个视野下 MSCs 平均数:正常组普食喂养(14.22 ± 1.85)，正常组龟板喂养(21.45 ±1.94)，损伤组普食喂养(18.68 ±2.34)，损伤组龟板喂养(27.06 ±1.45)。与正常组相比，无论普食或龟板喂养，肝损伤后移植MSCs 肝脏定植增加;与普食喂养组相比，无论正常或肝损伤大鼠，龟板喂养明显增高移植MSCs 的肝脏定植，差异均有统计学意义(P ＜0.05)。

3 讨论

通过对大鼠CCl4肝损伤模型的研究，我们发现龟板饲养可以明显减少肝纤维化程度相关指标，如I 型胶原面积百分比、Hyp 含量，并可降低肝功能损伤指标ALT 水平，同时增加肝脏活性指标血清白蛋白水平，为中药龟板促进急性肝损伤的修复提供了实验依据。我们前期研究发现龟板可促进移植MSCs 向肝脏归巢。因此，本研究中是以MSCs 移植做为背景研究龟板对损伤肝的修复作用。那么，龟板促损伤肝修复的作用是否与MSCs 有关呢?近来的研究发现，给予龟板口服液后能促进循环中MSCs 向受损的脊髓组织归巢，并在其内增殖，从而减轻神经损伤和病理改变，并增强神经干细胞增殖［4-5］。同时，龟板也可以增强移植MSCs 归巢后向神经元细胞分化。对脑缺血的大鼠进行MSCs 移植治疗时，给予龟板口服液和对照组大鼠相比，可明显增强移植MSCs 在缺血脑纹状体内的归巢和增殖［6］。这些发现均证实，龟板可通过影响干细胞的增殖分化从而参与器官的损伤和修复。但是否对肝脏组织中的MSCs 也有类似作用，目前尚无直接的实验证据。

另外，在本研究中还发现肝损伤后HGF 表达明显增加，而龟板饲养可进一步促进CCl4肝损伤大鼠肝脏的HGF 表达。一般认为，损伤局部的微环境和干细胞之间的相互作用促使干细胞向损伤部位定向优势分布。近来研究发现，肝细胞生长因子能介导干细胞优势分布。HGF 是一种间质源性生长因子，最初是从大鼠血浆和血小板中分离得到，是一种分泌型肝素亲和糖蛋白，具有重要的抗纤维化作用［7］。其配体c-met，已经证实MSCs 表达c-met。在本研究中，可以观察到肝损伤后 HGF 水平明显增高，这与 Kanemura 等［8］的研究相符，在肝脏发生损伤后，肝脏间质细胞分泌肝细胞生长因子并激活原癌基因c-met 的表达，因此血清HGF/c-met 水平高于正常水平，而我们的结论是基于肝组织HGF 水平测定所得，有更直接的证据意义。Kucia 等［9］在对缺血性脑损伤小鼠模型的研究中发现，HGF 可诱导MSCs 向损伤的神经组织归巢并促进神经组织的再生，但用抗c-met 抗体预处理MSCs 后，即封闭HGF 的受体后，MSCs 向损伤神经组织的归巢明显减少。该研究提示HGF/c-met 轴在介导MSCs 向损伤组织归巢中发挥重要作用。同样，Trapp 等［10］也发现HGF/c-met 轴能介导MSCs 向损伤组织的优势归巢。因此，我们推测MSCs 在HGF/c-met 轴介导下，能够优势归巢于肝脏损伤部位，也就是说，如果损伤部位的肝组织HGF 含量增加，可以促进MSCs 进入肝脏损伤部位。我们发现龟板饲养可进一步增加损伤肝脏的HGF 水平，同时促进移植的MSCs 向肝脏定植，这与上述理论推测相符，也为龟板促肝脏损伤修复的机制研究提供了新的线索。

综上所述，我们的研究提示龟板治疗可能通过HGF/c-met 轴上调MSCs 优势分布于肝脏组织，从而促进损伤肝修复。但上述可能机制只是相关性研究，还需要基因功能表达或抑制的研究进一步明确HGF/c-met 轴是否在上述过程中发挥了关键作用。

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