HPLC法测玉米蛋白粉和乳猪教槽料中色氨酸的含量

■宋吉英

（青岛农业大学化学与药学院，山东青岛 266109）

色氨酸又名α-氨基-β-吲哚丙酸，有DL-、D-和L-色氨酸三种异构体，天然存在的只有L-色氨酸，通常是仔猪日粮继赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸后的第四限制性氨基酸。研究表明，色氨酸可以调节动物肝脏蛋白质的合成[1]，可以提高动物大脑中5-羟色胺的浓度，提高仔猪采食量，与摄食低色氨酸浓度的日粮相比，摄食高色氨酸浓度日粮的仔猪将表现出较好的生长性能[2]。目前，对色氨酸的测定，多采用不同浓度、不同种类强碱水解样品，再用比色法、荧光法等方法定量[3-5]，本文重点探讨用HPLC法测定有代表性的饲料原料和配合饲料。

本文选取饲料原料中的玉米蛋白粉和配合饲料中的乳猪教槽料，来考察用HPLC法测定色氨酸的含量。玉米蛋白粉是经医药工业生产淀粉或酿酒工业提纯后的副产品，其蛋白营养成分可达60%以上，是饲料工业中常用的蛋白原料。教槽料俗称补料或者开口料，是指乳猪出生7 d后到断奶后7～10 d内使用的特殊饲料[6-7]，其中原料的添加需重点考虑猪的消化率、适口性和可消化氨基酸的平稳，因此需要添加一些优质的动物或植物蛋白。以上两种材料经碱水解后均可得到一定含量的色氨酸，是测定色氨酸含量比较有代表性的饲料原料和配合饲料。

1 仪器与试剂材料

1.1 仪器

Agilent1260高效液相色谱仪（配有Agi⁃lent1260系列二极管阵列检测器DAD），K241R型低温高速离心机，UVIKON XS型紫外分光光度计，GZX-9240MBE型电热鼓风干燥箱，KQ-600DE数控超声波清洗器，Lab860型台式酸度计，氮气瓶，聚四氟乙烯螺纹口瓶。

1.2 试剂与溶液

甲醇(色谱纯)，超纯水(用前过0.45 μm滤膜)，4 mol/l氢氧化锂溶液（一水合氢氧化锂16.78 g，用水溶解并定容到100 ml容量瓶中），6 mol/l盐酸溶液（将优级纯盐酸与水等体积混合），0.008 5 mol/l乙酸钠溶液（0.56 g无水乙酸钠溶于800 ml水中，再用乙酸调节pH值至4.0，用0.45 μm滤膜过滤），L-色氨酸标准储备液（准确称取色氨酸标准品2.98 mg，用上述乙酸钠溶液溶解，并定容到10 ml容量瓶中）。

1.3 材料

玉米蛋白粉和乳猪教槽料均来自于市购，烘干后粉碎，置于磨口瓶中保存备用。

2 结果与讨论

2.1 样品的前处理方法

称取1.000 0 g待测饲料试样，置于50 ml聚四氟乙烯螺纹口瓶中，加15 ml、4 mol/l氢氧化锂溶液，置于碎冰中冷冻，并通氮气6 min，拧紧瓶盖，并用封口膜封瓶。将封好的聚四氟乙烯瓶放入(110±1)℃的干燥箱中，水解24 h。取出水解瓶，冷却至室温，开瓶，加入大约10 ml，6 mol/l的盐酸中和，置于冰浴中缓慢滴加盐酸，调节pH值在6左右，然后，上机用0.008 5 mol/l乙酸钠溶液将水解液定量的转移到100 ml容量瓶中定容。摇匀，静置后取部分上清液于高速离心机中离心，离心后所得上清液过0.45 μm滤膜，然后封口置于冰箱中，供上机测定使用。

2.2 最佳吸收波长的选择

为了确定色氨酸的最佳紫外吸收波长，用紫外分光光度计在200～400 nm波长范围下扫描，得到如图1所示的扫描光谱，表明色氨酸在222 nm和279 nm波长条件下有较强的吸收，为了避免溶剂或其他杂质的干扰，所以本文选择280 nm作为色氨酸的检测波长。

2.3 色谱条件的选择

色谱柱：Agilent C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；流动相：0.008 5 mol/l乙酸钠溶液+甲醇=95+5；进样量20 μl。在以上色谱条件下进行上机分析测定，得到的色氨酸标准品谱图和两种饲料样品谱图如图2、图3、图4所示，色氨酸的出峰时间在13 min左右。

图1 色氨酸在200～400 nm波长下的扫描光谱

图3 玉米蛋白粉样品色谱

图4 乳猪教槽料样品色谱

2.4 标准溶液的制备及标准曲线的绘制

取2 ml L-色氨酸标准储备液，采用流动相逐级稀释法配成一系列不同浓度的L-色氨酸标准品溶液，在2.3节的色谱条件下进行分析。得到的谱图以浓度c为横坐标，峰面积A为纵坐标绘制标准曲线，如图5所示，回归方程为：A=30.891 7c-0.562 8，结果表明，色氨酸在4.646～298 mg/ml范围内，峰面积与其浓度线性关系良好(r=0.999 9)，计算得检出限为0.033 5 mg/ml。

图5 色氨酸标准工作曲线

2.5 前处理方法的精密度考察

分别取玉米蛋白粉和乳猪教槽料三份平行样进行前处理，处理后的样品按2.3节的色谱条件进行检测，得到三份玉米蛋白粉中色氨酸的平均含量为0.331%，测定量RSD值为3.67%；三份乳猪教槽料中色氨酸的平均含量为0.268%，测定量RSD值为0.94%。结果表明，前处理方法的精密度良好，该前处理方法适合饲料中色氨酸的测定。

2.6 检测方法的精密度考察

将玉米蛋白粉和乳猪教槽料经处理后的上机待测样品分别在高效液相色谱上连续进样5次，按2.3节的色谱条件进行测定。玉米蛋白粉中色氨酸的平均含量为0.345%，测定量RSD值为0.640%；乳猪教槽料中色氨酸的平均含量为0.266%，测得量RSD值为0.471%。结果表明，用高效液相色谱法测定色氨酸的含量具有良好的精密度。

2.7 空白加标回收

准确称取3份1.00 g不含氨基酸的饲料载体，各加入100 ml色氨酸标准储备液，用同样的前处理方法进行处理，用2.3节的色谱条件检测，结果（见表1）表明，平均回收率为99.04%，加入的色氨酸基本没有损失，该前处理方法准确、可靠。

表1 空白加标回收率测定结果

3 小结

本文建立了用高效液相色谱法测定玉米蛋白粉和乳猪教槽料中色氨酸的试验方法。本方法样品前处理将国标上的聚四氟乙烯衬管换成聚四氟乙烯螺纹口瓶，操作简单，色谱条件容易掌握，大大缩短了试验时间。方法的精密度和空白回收率都较高，完全可以满足分析要求，是测定饲料原料和配合饲料中色氨酸含量的可行有效的方法。