一株凝结芽孢杆菌芽孢抗逆性研究及其产孢条件优化

■余 岳王春维祝爱侠 李 涛

（1.武汉工业学院动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉 430023；2.武汉市畜禽饲料工程技术研究中心，湖北武汉 430023）

乳酸菌是葡萄糖或乳糖在发酵过程中产生乳酸的革兰氏阳性细菌的总称，绝大多数乳酸菌能调节动物肠道功能紊乱和维系内源微生态系统平衡，具有相当重要的生理功能[1]。然而传统的乳酸菌（如保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌等）不能生成芽孢，对高温、强酸、强碱及胆盐的耐受性较差，经制粒、膨化等加工过程制备成微生态饲料制剂并饲喂动物后能到达肠道的活菌数相对较少。

凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）属于硬（或厚）壁菌门肠道乳酸菌，是一类可产芽孢的特殊乳酸菌[2]。除了具有传统乳酸菌可调节动物肠道健康、提高消化能力和提高免疫力等作用外，其芽孢状态对环境具有相当的抗逆性，对高温、胃酸和胆盐都有一定的耐受能力[3]。1992年该菌种被美国食品与药物管理局（FDA）和美国饲料控制官员协会列入可用于饲料的安全菌株名单中[4]。芽孢体是凝结芽孢杆菌区别于传统乳酸菌的关键所在，也是制备微生态饲料制剂的理想形态[5]。本试验旨在研究实验室保藏的一株凝结芽孢杆菌BCRC11592对高温、强酸、胆盐的耐受能力及其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长抑制能力，并利用摇瓶液体发酵，优化凝结芽孢杆菌产孢率的培养条件，为微生态饲料制剂的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌种：凝结芽孢杆菌BCRC11592为本实验室筛选保藏。

种子培养基：胰蛋白胨10 g，牛肉浸出粉3 g，氯化钠5 g，水1 000 ml（固体培养基另添加15 g琼脂）；调pH值为7.0，121℃灭菌20 min后冷却至室温。

发酵培养基：胰蛋白胨10.0 g，牛肉浸出粉3 g，氯化钠5 g，葡萄糖6.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，K2HPO42.0 g，MnSO4·H2O 50 mg，水 1 000 ml；调 pH 值为7.0，121℃灭菌20 min后冷却至室温。

稀释液：添加0.1%吐温80的蒸馏水，121℃灭菌20 min后冷却至室温。

1.2 方法

1.2.1 活化菌株

将保存的菌株划线接种到种子固体斜面培养基中，37℃培养24 h。

1.2.2 种子菌液制备

挑取纯化培养的菌落于种子液体培养基中，37℃，150 r/min摇床培养24 h。

1.2.3 发酵培养液制备

将凝结芽孢杆菌种子液接种到发酵培养基中，37℃，150 r/min摇床培养24 h。

1.2.4 测定方法

①活菌数测定：以倾注法进行活菌计数[6]。

②芽孢数测定：将培养菌液置于80℃水浴加热10 min以充分灭活营养体菌体细胞，再以倾注法进行活菌计数[7]。

③产孢率公式

产孢率（%）=(芽孢数/活菌数)×100

2 结果与分析

2.1 抗逆性及抑菌性能试验

2.1.1 温度对凝结芽孢杆菌活菌数和存活率的影响

参考颗粒饲料制备过程中调质和造粒的具体时间和温度[8]，设定试验温度分别为60、70、80、90、100℃，试验时间均为10 min。吸取凝结芽孢杆菌发酵培养液100 μl于装有900 μl无菌水的离心管中，在不同温度下水浴加热10 min后，适度稀释，测定活菌数，以常温下的发酵培养液作为空白对照，计算凝结芽孢杆菌的存活率。试验重复3次，取平均值，下同。结果见图1。

图1 温度对凝结芽孢杆菌活菌数和存活率的影响

从图1可以看出，该凝结芽孢杆菌具有优秀的耐高温能力，在90℃和100℃的高温下处理10 min后存活率分别为81.9%和79.6%。

2.1.2 酸处理对凝结芽孢杆菌活菌数和存活率的影响

根据动物胃液pH值特点以及食糜在胃部停留时间，试验选取pH=2为耐受点，耐受时间分别为0.5、1、2、3和4 h[9]。吸取凝结芽孢杆菌发酵培养液100 μl于装有900 μl、pH=2的稀释液的离心管中，37 ℃恒温培养0.5、1、2、3和4 h后，适度稀释，测定活菌数，以pH=7的稀释液作为空白对照，计算凝结芽孢杆菌的存活率，结果如图2所示。

图2 酸处理对凝结芽孢杆菌活菌数和存活率的影响

图2结果表明，该凝结芽孢杆菌在pH=2.0的环境中保留4 h后的存活率仍超过了50%，具有优秀的耐酸能力。

2.1.3 胆盐对凝结芽孢杆菌活菌数和存活率的影响

根据动物肠道环境及食糜消化特点，试验选取胆盐浓度0.3%为耐受点，耐受时间分别为1、2、4、6、8 h[10]。吸取凝结芽孢杆菌发酵培养液100 μl于装有900 μl猪胆盐浓度为0.3%的稀释液的离心管中，37 ℃恒温培养1、2、4、6、8 h后，适度稀释，测定活菌数，以未添加猪胆盐的稀释液作为空白对照，计算凝结芽孢杆菌的存活率，结果见图3。

图3 胆盐对凝结芽孢杆菌活菌数和存活率的影响

图3结果表明，该凝结芽孢杆菌对胆盐的耐受能力很强，在0.3%的胆盐环境中8 h后的存活率可达79.4%。

2.1.4 抑菌试验

采用大肠杆菌CCRC10306和金黄色葡萄球菌CCRC1780为指标菌株进行抑菌试验。将指标菌用种子培养基37℃恒温培养36 h后，分别涂板、干燥，在培养基上打出直径为8 mm的孔洞。然后将凝结芽孢杆菌发酵培养液经3 000 r/min离心5 min后，吸取上清液100 μl注入孔洞内，37℃培养24 h，测量其抑菌圈大小[12]。并与普通保加利亚乳杆菌对比抑菌能力，结果见表1。

表1 抑菌试验结果（mm）

表1结果显示，该凝结芽孢杆菌对两种革兰氏阴性菌的生长有不同程度的抑制作用。与传统保加利亚乳杆菌相比，在对金黄色葡萄球菌的生长抑制方面性能稍弱，而对大肠杆菌生长抑制方面性能接近。

2.2 不同培养条件对其菌体生长和产孢率的影响在对该菌株抗逆性及其对革兰氏阴性菌生长

抑制能力的研究基础上，研究不同培养条件对其菌体生长和产孢率的影响。起始培养条件为pH值7.0，培养温度37℃，接种量105cfu（稀释种子菌液至105cfu/ml，移取1 000 μl至发酵培养基中），摇床转速180 r/min。

2.2.1 菌株生长曲线测定

用FP-1100-C型全自动生长曲线分析仪（芬兰OY Growth Curves公司生产）测定该菌株的生长曲线，以确定其初步生长特性。吸取凝结芽孢杆菌发酵培养液200 μl于蜂窝板孔中，设置培养温度为37℃，培养时间为48 h，“快速”转速档培养，于600 nm处每小时测定一次吸光值，结果如图4所示。

图4 菌株生长曲线

图4显示，该菌株培养0～4 h时处于生长调整期，活菌数相对较少；在5～12 h处于生长对数期，微生物以对数方式增殖，生长速度最快；12～33 h处于稳定期，活菌数在较高的范围保持稳定，新生和死亡达到平衡状态；33 h后处于衰亡期，微生物由于培养基中营养物质的消耗和自身副产物的积累而不断消亡，活菌数逐渐减少。

2.2.2 培养时间对其菌体生长和产孢率的影响

根据该菌株生长曲线显示，培养于12 h时进入菌体生长稳定期。试验设定培养时间分别为6、12、24、36、48 h。在不同培养时间后测定凝结芽孢杆菌活菌数和芽孢数，并计算其产孢率，结果见图5。

图5显示，活菌数随着培养时间延长先增大后减少，在12 h达到最大，而芽孢数在24 h最大，以最大芽孢数为优化标准，选用24 h为最优培养时间。

2.2.3 初始pH值对其菌体生长和产孢率的影响

试验设定液体培养基初始pH值分别为5.5、6、6.5、7、7.5。测定不同初始pH值条件下凝结芽孢杆菌的活菌数和芽孢数，并计算其产孢率，结果见图6。

图6显示，活菌数在pH=7时达到最大，但在此条件下产孢率较低导致芽孢数不高，而在pH=6.5时能获得最大芽孢数，故选用初始pH=6.5为最佳pH值。

图5 培养时间对其菌体生长和产孢率的影响

图6 初始pH值对其菌体生长和产孢率的影响

2.2.4 培养温度对其菌体生长和产孢率的影响

试验设定培养温度分别为 25、30、37、40、45℃，测定在不同培养温度条件下凝结芽孢杆菌的活菌数和芽孢数，并计算其产孢率，结果见图7。

图7 培养温度对其菌体生长和产孢率的影响

图7结果表明，该菌株在37℃时活菌数较高，但产孢率低下，在40℃时有较高的活菌数和产孢率，能获得最大芽孢数，故本试验选用40℃为最佳培养温度。

2.2.5 接种量对其菌体生长和产孢率的影响

试验分别设定接种量为103、104、105、106、107cfu。测定不同接种量下凝结芽孢杆菌的活菌数和芽孢数，并计算其产孢率，结果见图8。

图8 接种量对其菌体生长和产孢率的影响

图8结果表明，当接种量为104cfu时产孢率最大，但活菌数不高。接种量为106cfu时能获得最大芽孢数，故本试验选用106cfu为最佳接种量。

2.2.6 摇床转速对其菌体生长和产孢率的影响

分别测定摇床转速在 120、140、160、180、200 r/min条件下发酵后凝结芽孢杆菌的活菌数和芽孢数，并计算其产孢率，结果见图9。

图9 摇床转速对其菌体生长和产孢率的影响

图9结果表明，当摇床转速为140 r/min时，凝结芽孢杆菌生成的芽孢数多于其他转速，故本试验选用140 r/min为最佳摇床转速。

2.3 讨论

2.3.1 抗逆性和抑菌性能分析

本试验证明了凝结芽孢杆菌BCRC11592具有优秀的抗逆性能，而这种抗逆能力则与其本身能生成的芽孢体相关，这也应证了国外之前某些研究的结果[12]。芽孢是某些细菌在停止生长时产生的休眠体，具有独特而复杂的结构。其低水性的构造和极低的新陈代谢作用使其在抗热、抗化学物质、抗辐射和抗静水压等方面有很好的表现[13]。该凝结芽孢杆菌在耐高温方面的特性可以保证其在颗粒饲料制备过程中能保持高水平活菌数；同时在饲喂应用中，其对强酸和胆盐环境的耐受能力则能保证在胃液和肠液中的稳定性，从而能有足够的活菌数以发挥益生效用。而抑菌试验表明该凝结芽孢杆菌对两种革兰氏阴性菌的生长有一定的抑制作用。抑菌作用机制一般包括益生菌体分泌有机酸以降低肠道环境的pH值，与其它微生物竞争环境中的营养物质，降低氧化还原电位，产生过氧化氢以及产生特定的抑菌素等[14]。该凝结芽孢杆菌的抑菌作用属于哪种机制尚需进一步研究，不过可以肯定其具有改善肠道微生态环境的能力。综合以上结论，该菌株具备开发为微生态饲料制剂的潜力。

2.3.2 产孢条件优化结果分析

凝结芽孢杆菌为兼性厌氧菌，其所需的生长环境相对较宽松。但由于芽孢体往往在环境恶劣、营养缺乏的条件下生成，以抵御不良的外界因素。因此较适宜的温度、pH值和较高摇床转速能带来更高的活菌数，但是不利于其芽孢体的生成。而过于恶劣的温度、pH值以及过低的转速则会影响菌体的正常生长，菌体浓度过低，同样不利于高芽孢数的获得[15]。根据该菌体的生长曲线可知，其在12 h可达到菌体生长稳定期，具有最高的菌体浓度，而芽孢体往往形成于菌体生长后期，本试验优化后的24 h培养时间与该结论相吻合。

本试验通过摇瓶培养获得最大芽孢数为3.0×108cfu/ml，而进行发酵罐扩大规模培养时可能会有不同结果，此方面问题尚待进一步研究。

3 结论

在本试验条件下，可得出以下结论：

①该凝结芽孢杆菌具有优秀的抗逆性能，且这种抗逆能力与其本身能生成的芽孢体相关。

②该凝结芽孢杆菌对两种革兰氏阴性菌的生长有一定的抑制作用。

③该凝结芽孢杆菌的最佳产孢条件为培养时间24 h、培养温度40℃、初始pH值为6.5、接种量为106cfu和摇床转数为140 r/min，在此条件下菌液活菌数为3.5×108cfu/ml，芽孢数为3.0×108cfu/ml，产孢率为85.7%