双酶分步水解制备棉籽多肽工艺条件优化

■ 黄 薇 林 虬 宋永康 姚清华

(1.福建省农业科学院中心实验室，福建福州 350003；2.福建省精密仪器农业测试重点实验室，福建福州 350003)

我国是世界上主要的产棉大国，棉籽产量约占世界总产量的10%，棉籽蛋白的营养价值比谷类蛋白高，近似豆类蛋白，是一种理想的植物蛋白质资源。但长期以来，棉籽蛋白因含有棉酚等有毒有害物质而使其用途受到局限，未能得到很好的开发利用。随着棉酚提取工艺以及无腺棉籽种植的广泛推广，棉籽蛋白资源受到了食品工业和饲料工业的广泛关注，如何进一步开发和利用棉籽蛋白资源成为了当前研究的热点。

使用生物催化技术将蛋白质转化成多肽、寡肽等，已被证实是开发利用低值蛋白资源的重要途径。在对酶解法生产棉籽多肽的研究中，单酶水解法依旧是当前研究的主要方向。但随着研究的深入，发现采用双酶分步水解法可以显著提高蛋白质的水解效率和程度。郭城等研究结果表明，采用Alcalase水解棉籽蛋白300 min，灭酶后再加入中性蛋白酶AS1.398继续作用100 min，水解度可达20.08%，效果要优于单酶水解。

本课题组从6种商品化蛋白酶中筛选出双酶分步水解法制备高多肽得率的棉籽多肽用蛋白酶Alcalase酶和Flavourzyme酶。在此基础上，本研究对双酶分步水解棉籽蛋白工艺的多种影响因素进行了研究，探索出了分步酶解棉籽蛋白的最适工艺参数，在较短时间内提高棉籽蛋白的多肽得率，为棉籽蛋白多肽的产业化开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

棉籽蛋白：市售，蛋白含量为37.77%；Alcalase酶：内切肽酶活性，酶活力380 000 U/ml，诺维信公司；Flavourzyme酶：内切肽酶和外切肽酶两种活性，酶活力430 000 U/ml，诺维信公司；三氯乙酸（TCA）、氢氧化钠、盐酸等其他试剂均为分析纯。

1.2 主要设备

全自动凯氏定氮仪（瑞典Foss KIELETEC ANALYSISER），电子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO AL204），恒温磁力搅拌器（国华企业 HJ-3），恒温振荡器（国华企业 3HA-C），离心机（长沙湘仪离心机 TD5A-WS），pH酸度计（上海雷磁PHS-3C）。

1.3 试验方法

1.3.1 棉籽蛋白水解

棉籽蛋白的溶解性较差，水解前对棉籽蛋白进行预处理能够显著提高水解的效果。酶解前首先对棉籽蛋白进行粉碎过筛至60目左右，按试验设计配制成一定质量浓度的棉籽蛋白质溶液，40℃浸提2 h，作为酶反应的底物溶液。调节反应体系达到Alcalase酶水解条件，进行水解一定时间后，95℃水浴灭酶15 min，再调pH值、温度加入Flavourzyme酶继续水解至预定时间，完毕后灭酶，冷却。

1.3.2 多肽得率的测定

对特定底物而言，三氯乙酸可以定性地反映蛋白质的分解情况，溶解指数越高，表明较短肽链的含量也越高。多肽得率采用三氯乙酸可溶性氮法（TCA-SNI）进行检测。

1.3.3 Plackett-Burrman设计

在前期单因素试验的基础上，采用Plackett-Burman设计试验对影响双酶分步水解棉籽蛋白的9个因素进行评估。Plackett-Burman设计试验因素水平见表1。

表1 Plackett-Burman设计试验因素水平

每个因素各取低水平（-1）和高水平（+1）两个水平，其中X10,X11为估计误差而设置的对照虚拟因子。

1.3.4 响应面试验设计

运用Box-Behnken中心组合试验设计原理，对Plackett-Burman设计试验筛选出的关键因素（底物浓度、Alcalase酶反应温度、Flavourzyme酶加酶量）进行响应面试验设计，见表2。同时固定其他非关键因素：Alcalase酶反应时间150 min，Alca⁃lase酶反应pH值8.0，Alcalase酶酶用量25 000 U/g，Flavourzyme酶反应时间120 min，Flavourzyme酶反应pH值6.0，Flavourzyme酶反应温度50℃。

表2 响应面优化的因素和水平设计

2 结果与讨论

2.1 Plackett-Burrman设计筛选主效因素

以多肽得率(%)为响应值，Plackett-Burrman设计试验与结果见表3。对表中数据进行回归分析，得到各影响因子的回归系数及其显著性(见表4)。

从分析结果中可以看出，主要影响因子为因素 X1(底物浓度)、X5(Alcalase酶反应温度)、X7（Flavourzyme酶加酶量），其贡献率分别为：50.49%、14.26%和22.74%，且对多肽得率的影响均达到显著水平（P＜0.05）。

表3 Plackett-Burman设计试验与结果

表4 Plackett-Burman设计试验方差分析和回归系数估计

方差分析模型的P值为0.040 4，表明所得回归方程达到极显著，整个回归区域拟合较好。复相关系数R2=0.990 9，校正决定系数Adj R2=0.949 8，表明此回归模型相关性好，能解释94.98%的试验数据的变异。模型的信噪比（Adeq precision）为15.467，大于4视为满意模型，表明该模型为满意模型。

2.2 Box-Behnken中心组合优化设计结果与响应面分析

2.2.1 多元二次回归方程的建立及检验

对Plackett-Burrman设计筛选出的3个主效影响因素：底物浓度、Alcalase酶反应温度、Fla⁃vourzyme酶加酶量，开展N=17的三因素三水平的Box-Behnken的中心组合设计试验，试验结果见表5。利用Design Expert 8.0软件对试验数据进行多元回归拟合，得到双酶分步水解棉籽蛋白的多项式回归模型如下：

对上述模型进行回归系数显著性检验(见表6),式中X1、X2、X3一次项和X1X2、X12、X22、X32的二次项对多肽得率的影响极显著，X2X3对多肽得率的影响显著。该二次多项模型的P值＜0.000 1，显示该模型高度显著；失拟项反映试验数据与模型不相符情况，其P值为0.372 0＞0.1，在a=0.1水平上不显著，说明模型选择正确；多元相关系数为R2=0.981 5，校正决定系数Adj R2=0.957 8，表明此回归模型能解释95.78%响应值的变异，说明模型对实际情况拟合程度良好；模型的信噪比（Adeq pre⁃cision）为20.820（＞4），说明本模型的设计对双酶分步水解棉籽蛋白的条件进行优化是合适的。

表5 Box-Behnken设计矩阵和响应数据的实测值与拟合值

表6 二次多项模型方差分析

2.2.2 响应面分析与优化

经过Design Expert软件分析，得到各交互因素对多肽得率的响应面曲面图及其等高线图，见图1～图3。其中等高线的形状反映出交互效应的强弱大小，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则相反。

图1 底物浓度和Alcalase酶反应温度交互影响的三维曲面图和等高线

图2 底物浓度和Flavourzyme酶加酶量交互影响的三维曲面图和等高线

图1显示了底物浓度与Alcalase酶反应温度对响应值多肽得率的交互影响效应。从其等高线图可以直观的看出底物浓度与Alcalase酶反应温度的交互作用显著。在本次试验水平范围内，当底物浓度为8.62%，Alcalas酶反应温度为59.3℃时，多肽得率达到最大值64.81%。

底物浓度与Flavourzyme酶加酶量对多肽得率的交互作用见图2。从等高线的图形中可以看出两者交互作用不显著。当底物浓度为8.24%，Flavourzyme酶加酶量约为28 000 U/g，多肽得率可以达到最大值。

图3 Alcalase酶反应温度和Flavourzyme酶加酶量交互影响的三维曲面图和等高线

从图3中可以看出Alcalase酶反应温度和Fla⁃vourzyme酶加酶量对多肽得率的交互作用。由等高线图可见，该两因素对多肽得率的交互作用显著，当 Alcalase酶反应温度约为59～60 ℃、Fla⁃vourzyme酶加酶量约为26 000～27 000 U/g时，多肽得率可以达到本试验中的最大值64.50%。

2.3 验证试验

根据Box-Behnken中心组合优化设计试验所得的结果和二次多项回归方程，得到最佳水解条件为底物浓度(w/v)8.36%，Alcalase酶在温度59.9℃、pH值8.0、酶用量25 000 U/g的条件下水解150 min，再用Flavourzyme酶在温度50℃、pH值6.0、酶用量27 430 U/g的条件下水解120 min，酶解液的多肽得率可达到65.07%。为了检验模型预测的准确性，采用上述优化后的工艺条件对棉籽蛋白进行水解验证试验，实测多肽得率结果分别为64.88%、64.75%和65.02%，与预测值较接近，表明了Plackett-Burrman设计和Box-Behnken响应面分析法联用的可行性以及所得模型能较好地预测实际水解情况。

3 结语

在试验条件优化方面，依靠正交试验或均匀设计难以得到较快较好的结果。响应面分析法（Re⁃sponse Surface Methodology,简称RSM）是一种工艺条件优化的有效方法，可用于确定试验因素及其交互作用在工艺过程中对指标响应值的影响，精确地表述因素和响应值之间的关系。姜晓娇等应用响应面法的Box-Behnken中心组合试验进行设计，以棉籽多肽产率为响应值，对碱性蛋白酶酶解制备棉籽多肽的条件进行了优化，优化得到的棉籽多肽产率为49.60%。Plackett-Burman（PB）设计主要应用于微生物发酵工艺关键参数的筛选和发酵培养基成分的优化，能够从众多操作条件中快速有效的筛选出主效因素，从而减少优化过程中的考察因素数和试验次数。目前将PB筛选和响应面分析联合应用于棉籽蛋白酶解工艺的优化尚未见报道。

本研究以多肽得率为响应值，将PB筛选和RSM分析相结合成功地应用于棉籽蛋白双酶分步水解的工艺条件优化，并确定最佳水解条件为，底物浓度(w/v)8.36%，先用Alcalase酶在温度59.9℃、pH值8.0、酶用量25 000 U/g的条件下水解150 min，再用Flavourzyme酶在温度50℃、pH值6.0、酶用量27 430 U/g的条件下水解120 min，在最佳条件下，多肽得率可达到65.07%。经方差分析可知Plack⁃ett-Burrman设计试验筛选得到的关键因子对棉籽多肽得率的影响都是显著的，底物浓度与Alcalase酶反应温度以及Alcalase酶反应温度与Fla⁃vourzyme酶加酶量的交互影响也显著。验证试验证明，PB筛选和响应面分析法可以有效的优化双酶分步水解棉籽蛋白的水解参数，这对棉籽肽蛋白的工业化生产具有一定的指导意义。

（参考文献19篇，刊略，需者可函索）