喂食甘草甜素对点带石斑鱼非特异性免疫力的影响

■崔 培 陈成勋 王庆奎 邢克智 赵海运

(天津市水产生态与养殖重点实验室，天津农学院水产科学系，天津 300384)

点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)隶属于鲈形目、鮨科、石斑鱼亚科、石斑鱼属，其肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富，享有上等佳肴之美誉，是东南亚沿海重要的高档海水养殖鱼类之一。近年来，点带石斑鱼高密度养殖在我国福建、广东、广西和海南沿海地区发展迅速。但随着集约化、设施化高密度养殖模式的扩大，加上配合饲料质量不均衡，导致养殖环境恶化，自身健康状况下降等一系列问题的出现，在养殖过程中爆发大规模的疾病[1-3]，给养殖户带来相当大的经济损失。因此迫切需要寻找能够提高点带石斑鱼非特异性免疫力和抗病力的免疫增强剂。

甘草(Glycyrrhiza uralensis Fiseh)，又名甜草根、甜甘草、甜根子、粉草等，为豆科(Legum inosae)甘草属(Glycyrrhiza)多年生宿根草本植物，在传统中医药中被称为“百草之王”。其性平味甘，在临床上具有抗病毒、抗细菌、抗氧化、抗衰老、增效解毒，增强巨噬细胞吞噬能力等作用[4-5]。已有研究发现，甘草可提高肉鸡的进食欲望，降低能耗，还可促进山羊T淋巴细胞转化率，从而增强其细胞免疫功能[6]。王文博等[7]也发现甘草粗提物对鲫免疫功能有良好的调节作用。但有关甘草甜素对点带石斑鱼免疫功能的影响尚未见报道，因此，本试验在饲料中添加不同水平的甘草甜素，研究其对点带石斑鱼非特异性免疫的影响，为石斑鱼工厂化健康养殖以及为甘草甜素在水产饲料中的应用提供一些参考。

1 试验材料及方法

1.1 试验材料

试验用点带石斑鱼[(84.11±0.50)g]由天津市海发珍品实业有限公司提供。

1.2 试验设计和日常管理

基础饲料中分别添加0、50、200、350、500 mg/kg甘草甜素，制成5种试验饲料。基础饲料配方见表1，复合维生素和复合矿物质按暖水性鱼类的营养需求添加[8]。试验分为5组，每组3个重复，每个重复饲喂2箱，共30箱，每箱30尾。每7 d取样1次，每次取3箱，每箱15尾，测定血液中的非特异性免疫指标。

表1 基础饲料原料组成（%）

试验用水经生物包处理、充纯氧，并经紫外线消毒后使用，采用循环流水，24 h充气。饲养期间，水温保持在26～28 ℃，盐度28～30，溶解氧5.6～6.5 mg/l，NH4+-N 1.00～1.50 mg/l，NO2--N 0.15～0.40 mg/l。每天换水3次，换水时清除粪便。每天喂食2次（早8:30，晚4:00），每次饱食投喂。

1.3 测定指标及测定方法

试验鱼用MS-222麻醉后，尾柄采血，离心(5 000 r/min、10 min、4 ℃)，-80 ℃保存，测定血清溶菌酶(LZM)活力、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活力，总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)含量，补体C3和C4含量。另一部分用5%肝素钠抗凝，计数血液中的白细胞数。

ACP、AKP、TP和ALB用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定，补体C3和C4用浙江伊利康生物技术有限公司生产的试剂盒进行测定。白蛋白/球蛋白（A/G）=A/(TP-A)[9]。

1.3.1 溶菌酶（LZM）活力的测定

将活化后的溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)用 PBS(pH 值 6.4)将浓度调至 OD570≈0.3，取150 μl菌悬液均匀涂布在固体培养基上。在培养基上等间距放置直径4.32 mm的灭菌滤纸片，向滤纸片中心滴加浓度分别为375、750、1 125、1 500、1 875、2 250 U/ml的溶菌酶标准品溶液10 μl，28℃于培养箱中倒置培养12 h后测量抑菌圈直径。以抑菌圈直径为横坐标(X)，溶菌酶标准品浓度的对数为纵坐标(Y)得到回归方程。取10 μl血清加在滤纸片上，按上述方法孵育，测量抑菌圈直径。将抑菌圈直径代入回归方程，计算出血清中溶菌酶活力。

1.3.2 血液白细胞计数

血液用白细胞稀释液稀释100倍。白细胞稀释液配制如下：98 ml蒸馏水加入1%亚甲蓝3滴，冰醋酸2 ml，配制成100 ml白细胞稀释液。血液白细胞数（个/l）=5个大方格中白细胞数×50 000×1 000×稀释倍数。

1.4 数据统计

所有数据用EXCEL软件计算平均值和标准差，试验数据以“平均值±标准差(Mean±SD)”表示。采用SPSS13.0进行相关性检验，单因素方差分析检验试验组间显著性，若组间差异显著(P＜0.05)，则作Duncan’s法多重比较分析。

2 结果

2.1 溶菌酶（LZM）的活力（见表2）

表2 点带石斑鱼血清LZM活力（U/g prot.）

由表2可知，第7 d时，各试验组的LZM活力均高于0 mg/kg组，其中，350 mg/kg组和500 mg/kg组显著高于0 mg/kg组，14 d时50 mg/kg组显著高于0 mg/kg组，而第21、28 d各试验组与0 mg/kg组间均无显著差异。

2.2 血清酸性磷酸酶（ACP）活力

表3 点带石斑鱼血清ACP活力（U/100 ml）

甘草甜素对点带石斑鱼血清ACP的影响见表3。在第7 d时，除50 mg/kg组外，其他各组均显著高于0 mg/kg组；第14 d时，350 mg/kg组和500 mg/kg组显著低于0 mg/kg组。

2.3 血清碱性磷酸酶（AKP）活力

甘草甜素对点带石斑鱼血清AKP的影响见表4。在第7、21 d以及28 d时，各试验组AKP活力与0 mg/kg组相比，均无显著差异；第14 d时，各试验组AKP活力均低于0 mg/kg组，其中，500 mg/kg组显著低于0 mg/kg组。

表4 点带石斑鱼血清AKP活力（U/100 ml）

2.4 补体C3和C4的活力

甘草甜素对点带石斑鱼血清补体C3的影响见表5。第7 d时，各试验组的补体C3含量均高于0 mg/kg组，其中，500 mg/kg组显著高于0 mg/kg组，第14、21、28 d时，各试验组补体C3含量均与0 mg/kg组无显著差异（P＞0.05）。

表5 点带石斑鱼血清补体C3含量（g/l）

甘草甜素对点带石斑鱼血清补体C4的影响见表6。第7 d时，各试验组补体C4活性均高于0 mg/kg组，且350 mg/kg组显著高于0 mg/kg组；第14 d时，350 mg/kg组和500 mg/kg组显著低于0 mg/kg组；第21 d和28 d，各试验组与0 mg/kg组相比均无显著差异（P＞0.05）。

表6 点带石斑鱼血清补体C4含量（g/l）

2.5 白蛋白/球白蛋比值

甘草甜素对点带石斑鱼血清A/G比值见表7。第7 d时，各试验组的A/G比值均显著低于0 mg/kg组(P＜0.05)；第14、21 d时，各试验组的白蛋白/球蛋白比值与0 mg/kg组相比均无显著差异(P＞0.05)；第28 d时，200 mg/kg组显著高于0 mg/kg组(P＜0.05)。

2.6 白细胞数目

甘草甜素对点带石斑鱼血液中白细胞数目的影响见表8。第7 d时50 mg/kg组和350 mg/kg组白细胞数目均显著高于0 mg/kg组（P＜0.05）；第14、21、28 d时，各试验组白细胞数目与0 mg/kg组相比无显著差异（P＞0.05）。

表7 点带石斑鱼血清白蛋白/球蛋白(A/G)比值（mg/ml）

表8 点带石斑鱼血液白细胞数目（×1011个/l）

3 讨论与小结

LZM是一种体液免疫指标，它是机体受到外界刺激的一项基本防御机制，广泛存在于生物体液、血清和巨噬细胞中，在动物免疫防御中发挥重要作用，其活性高低是决定吞噬细胞能否杀灭所吞噬致病菌的物质基础之一[10-13]。陈超然等[14]对中华鳖的研究发现，在饲料中添加15、25、35、45、55 mg/kg的甘草素对其血清LZM活性没有显著影响。杨兴斌等[15]用3种不同分子量大小的当归多糖体外培养小鼠腹腔巨噬细胞48 h后发现当归多糖能显著提高巨噬细胞LZM活力。王庆奎等[16]对点带石斑鱼的研究发现，喂食当归多糖350、500 mg/kg组7 d后能显著提高点带石斑鱼血浆LZM活力，而14～28 d内LZM活力与0 mg/kg组无显著差异。本试验中，第7 d时，各试验组的LZM活力均高于0 mg/kg组，其中，350 mg/kg组和500 mg/kg组显著高于0 mg/kg组，第14 d时，50 mg/kg组显著高于0 mg/kg组，其他各组以及第21 d、28 d各试验组与0 mg/kg组相比均无显著差异。说明投喂高剂量(350、500 mg/kg组)的甘草甜素能在短时间(7 d)内提高点带石斑鱼血清LZM活力，投喂50 mg/kg的甘草甜素14 d也可显著提高LZM活力，但随着喂食时间的延长LZM活力恢复至0 mg/kg组水平。

酸性磷酸酶（ACP）是巨噬细胞溶酶体的标志酶，与机体物质代谢关系密切，它通过催化磷蛋白中磷酯键的水解，直接参与磷酸基团的转移和代谢，在体内细胞调节过程中起重要作用。周进等[17]发现，投喂含A3α肽聚糖的饲料40 d后，可以显著提高牙鲆（Paralichthys olivaceus）肝脏中ACP活力。牟海津等[18]对栉孔扇贝的研究发现，经虫草多糖和海藻多糖注射刺激后，栉孔扇贝血清中ACP活性增强。吴桂玲[19]在饲料中添加100 mg/kg和500 mg/kg A3α肽聚糖喂食花鲈(Lateolabrax japonicus)，结果发现，42 d后花鲈肝脏ACP活力与0 mg/kg组无显著差异，而喂食84 d后两组的ACP活力均显著低于0 mg/kg组，并认为这是由于出现免疫疲劳所致。本试验中，投喂第7 d时，除50 mg/kg组外，其他各组均显著高于0 mg/kg组。

碱性磷酸酶(AKP)广泛存在于微生物和动物界，能催化所有的磷酸单脂的水解反应及磷酸基团的转移反应，AKP活性与动物的生长呈正相关，在一定程度上反映动物的生长速度[20]。柯浩等[21]试验发现，投喂中草药2号的鲍中AKP酶活力极显著高于对照。本试验中，在第7、21 d以及28 d时，各试验组AKP活力与0 mg/kg组相比，均无显著差异，第14 d时，各试验组AKP活力均低于0 mg/kg组，其中，500 mg/kg组显著低于0 mg/kg组。

硬骨鱼类的补体系统在防御细菌、病毒、真菌和寄生虫侵袭过程中具有重要作用，也可介导免疫病理的损伤性反应，是机体内具有重要生物学意义的效应系统和效应放大系统[22]。补体C3是补体系统中含量最多、最重要的一个组分，它是补体两条主要激活途径的中心环节，被激活后裂解为C3a和C3b。C3a参与具有C3a受体的白细胞结合，在炎症反应中起关键作用。补体C4是补体经典激活途径的一个重要组分，是补体活化的经典途径和MBL途径的必要成分，裂解产物C4b参与C3的裂解及后续的补体反应[23]。研究发现：在饲料中添加适量免疫多糖（酵母细胞壁）可以增强中华鳖中补体C3和C4的活性，但添加过量后则会抑制补体C3和C4活性。本试验中，投喂甘草甜素7 d可提高补体C3和C4含量，且500 mg/kg组的补体C3含量显著高于0 mg/kg组，350 mg/kg组的补体C4含量显著高于0 mg/kg组。

A/G值是反映鱼类非特异性免疫力的重要指标，A/G值越低说明免疫球蛋白含量越高，免疫力越高[9]。本研究发现喂食甘草甜素7 d能显著降低A/G值。

在鱼类血细胞中,吞噬细胞、中性粒细胞、巨噬细胞都具有吞噬异物的能力，是鱼类非特异性免疫的主要指标之一，它们的数量和吞噬能力的高低可直接反映出鱼类非特异性免疫能力的大小，在鱼类的非特异性免疫中起着至关重要的作用。本试验中，第7 d时添加甘草甜素50、350 mg/kg组白细胞数目明显增多。

投喂350 mg/kg组和500 mg/kg组的甘草甜素7 d可以显著提高点带石斑鱼血清LZM、ACP活力，显著降低A/G值，投喂500 mg/kg组的甘草甜素7 d可以显著提高血清补体C3含量，投喂350 mg/kg组的甘草甜素7 d可以显著提高血清补体C4含量，增加白细胞数目。因此，建议饲料中添加量为350 mg/kg，连续喂食7 d。