高钼对小尾寒羊肾脏超微结构和功能的影响

■张 鹏 杨自军 宋 超 王亚垒 张菲菲 朱重伟 尚泽松

（河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471003）

钼（Molybdenum，Mo）是动物体内必需的一种微量元素，是多种酶的组成成分，参与体内碳水化合物、脂肪、蛋白质、含硫氨基酸、核酸等的代谢，具有重要的生物学功能[1]。但摄入过量的钼可导致动物中毒[2-3]。已经证实，高钼对动物的多种组织器官具有损害作用[4-5]。肾脏是动物体内钼含量最高的器官之一，有研究表明肾脏也是钼毒性的靶器官[6-7]。目前，尚未见钼暴露对小尾寒羊肾脏超微结构和肾脏功能影响的研究报道。本试验选择钼暴露小尾寒羊的肾脏为研究器官，检测肾功能并观察肾脏超微结构的变化，旨在探讨高钼对小尾寒羊肾脏功能的影响和病理损伤的机理，为系统研究钼对肾脏的影响提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物与日粮

2月龄健康雄性小尾寒羊18只，体重（20±1.34）kg，随机分为3组，基础日粮相同，根据体重每日分别灌服0 mg/kg（Ⅰ组）、30 mg/kg（Ⅱ组）、60 mg/kg（Ⅲ组）的钼（钼源为Na2MoO4·2H2O，分析纯）。试验羊常规饲养管理，自由饮水和采食，体重7 d称量一次。基础日粮配方及营养水平见表1。

表1 日粮配方及营养水平

1.2 试验方法

1.2.1 临床观察

试验羊提前集体驱虫，自灌服钼溶液开始，每天观察各组试验羊的精神状态、食欲、皮肤被毛等情况。

1.2.2 血清肌酐和尿素氮含量的检测

试验第0、15、30、45、60 d，每组随机抽取4只小尾寒羊，空腹8 h后颈静脉采血，分离血清，用于血清肌酐（Cr）和尿素氮(BUN)含量的测定。检测试剂盒购于南京建成生物工程公司。

1.2.3 尿蛋白含量的检测

试验第0、15、30、45、60 d，每组随机抽取4只小尾寒羊，采集一昼夜的尿液，用加热醋酸法进行尿蛋白定性分析。

1.2.4 肾脏的超微结构观察

试验第60 d，各组随机挑选3只试验羊宰杀，立即将肾脏组织修剪成1 mm3小块，2.5%戊二醛溶液中固定，Epon 812包埋，超薄切片，锇酸染色，透射电镜（JEM-100SX）观察肾脏的超微结构变化。

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0分析软件进行数据统计分析，数据均以“平均值±标准差”表示，用Bonferroni多重比较法对各组数据进行显著性比较。

2 结果

2.1 临床观察

在整个试验期内，Ⅰ组小尾寒羊未出现明显病征。试验第10 d开始，Ⅱ、Ⅲ组小尾寒羊先后出现精神萎顿，食欲下降，消瘦等情况；35 d以后，Ⅱ、Ⅲ组试验羊普遍消瘦明显，粪便稀软如泥，喜卧少动，口色苍白。

50 d以后，Ⅱ、Ⅲ组试验羊出现不同程度的运动障碍，表现为行走蹒跚，站立不稳，但无明显关节肿胀变形；试验后期Ⅱ、Ⅲ组试验羊出现被毛脱落现象，严重者背部可见裸露皮肤，皮肤干燥苍白。

2.2 肾脏功能检测

2.2.1 血清肌酐和尿素氮含量的变化(见表2)

表2 血清肌酐、尿素氮浓度的变化（μmol/l）

Ⅰ组血清肌酐和尿素氮浓度前后无明显变化（P＞0.05）。Ⅱ、Ⅲ组血清肌酐浓度随时间的延长呈缓慢上升趋势，在第15 d和45 d，两组之间差异极显著（P＜0.01）。Ⅱ、Ⅲ组血清尿素氮浓度呈持续上升趋势，从30 d开始，Ⅱ、Ⅲ组血清尿素氮浓度与Ⅰ组差异极显著（P＜0.01），Ⅱ、Ⅲ组之间无显著差异（P＞0.05）。

2.2.2 尿蛋白量的检测（见表3）

表3 各组试验羊不同阶段尿蛋白量（g/l）

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组在试验开始前的尿蛋白量差异不显著，都在0.1 g/l左右。随着饲喂时间的延长，Ⅱ、Ⅲ组试验羊的尿蛋白量均呈上升趋势（P＜0.01或P＜0.05）。试验第45 d，Ⅲ组试验羊的尿蛋白量达0.60 g/l，且Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组之间尿蛋白量差异极显著（P＜0.01）。

2.3 超微结构变化

图1 Ⅰ组肾小管上皮细胞（TEM×20 000）

图2 Ⅱ组血管球系膜细胞，溶酶体增多（TEM×10 000）

图3 Ⅱ组肾小管上皮细胞，线粒体肿胀，粗面内质网脱颗粒（TEM×20 000）

Ⅰ组肾小球和肾小管均无明显的超微结构变化，胞核及各种细胞器的形态均无异常(见图1)；Ⅱ组肾小球毛细血管腔略有肿胀，血管球系膜细胞内溶酶体增多(见图2)，肾小管上皮细胞粗面内质网增生，脱颗粒。线粒体有轻度变形、肿胀(见图3)，部分细胞内质网扩张明显(见图4)；Ⅲ组肾小管上皮细胞空泡化现象普遍(见图5)，同时细胞内溶酶体明显增多，血管球基膜出现沉积性基膜增厚，电镜下可见基膜和内皮细胞之间有电子致密物沉积(见图6)。部分细胞核胞质浓缩，嗜酸性反应增强，染色质浓缩边集于核膜下，胞核周围可见较多初级溶酶体(见图7)。肾小球上皮细胞内可见多数线粒体因肿胀而变大变圆，电子密度增加，严重者形成空泡(见图8、图9)。部分上皮细胞胞浆溶解，细胞器消失，仅剩空泡化的线粒体，足突发生融合，裂管消失，原来附于基底的排列有序的足突代之以带状结构，贴敷于基底膜上。毛细血管基底膜微细结构消失(见图10)。

图4 Ⅱ组肾小管上皮细胞，内质网扩张明显（TEM×20 000）

图5 Ⅲ组肾小管上皮细胞，细胞空泡化（TEM×5 000）

图6 Ⅲ组肾小管上皮细胞，溶酶体增多，血管球基膜增厚（TEM×5 000）

图7 Ⅲ组肾小管上皮细胞，染色质浓缩边集于核膜下（TEM×8 000）

图8 Ⅲ组肾小球上皮细胞，线粒体肿胀（TEM×20 000）

图9 Ⅲ组肾小球上皮细胞，线粒体空泡化（TEM×20 000）

3 讨论与结论

3.1 高钼对小尾寒羊肾脏超微结构的影响

本试验中后期高钼组小尾寒羊出现腹泻、被毛脱落、行走蹒跚等典型钼中毒症状，且Ⅲ组试验羊临床状态最差。超微结构观察表明，钼中毒所致肾脏损伤主要集中在细胞中的膜系结构，导致内质网扩张、脱颗粒，线粒体肿胀变性甚至空泡化，溶酶体增多等。这与前人对雏鸡钼中毒的研究结果相似[7]。本试验中，受损伤的肾小管上皮细胞线粒体基质肿胀，嵴减少甚至消失，内层膜结构破损后在基质中重新闭合形成空泡；溶酶体明显增多、增大，内含颗粒样高电子密度物质；部分上皮细胞核染色质浓缩边集，有凋亡趋势。而肾小球的损伤主要体现在血管球基膜和足细胞结构上的变化，如血管基膜增厚，足细胞裂管消失等。因此推测，钼中毒所致肾脏的损害主要是肾小管上皮细胞受损，严重时累及肾小球。

图10 肾小球上皮细胞，胞浆溶解，足突发生融合，裂管消失（TEM×5 000）

3.2 高钼对小尾寒羊肾脏功能的影响

肌酐主要来自于肌肉的代谢，经肾脏滤过并随尿液排出体外，其在血中的浓度可反映肾脏滤过能力[8]。本试验中血清肌酐含量随着钼暴露时间的延长而呈上升趋势，说明高剂量的钼使肾小球滤过率下降，造成血液中肌酐含量上升，提示肾功能下降。尿素氮是体内蛋白质代谢的主要终产物，90%以上通过肾脏排泄，尿素从肾小球滤过后在各段小管均可重吸收[9]。本试验结果显示，在钼添加量超过30 mg/kg时，从第30 d开始Ⅱ、Ⅲ组尿素氮含量极显著高于Ⅰ组，说明高钼在影响肾小球滤过功能的同时干扰肾小管对尿素氮的重吸收，导致动物机体尿素代谢紊乱。正常尿液中蛋白含量不会超过0.5 g/l，尿液中蛋白增多是肾脏受损的一个重要标志，其含量与持续程度是判断肾脏损伤程度的依据[10-11]。本试验结果显示，随着钼暴露时间的延长，试验羊的尿蛋白量呈快速上升趋势，在试验第45 d时，Ⅲ组试验羊的尿蛋白量达0.6 g/l，且Ⅱ、Ⅲ组之间差异极显著（P＜0.01），提示肾功能受损伤程度与钼暴露水平之间存在剂量-时间效应关系。