不同来源木聚糖酶在模拟胃液和肠液中的稳定性评价

■姚丹丹 钱宇英 石学刚

（1.杰能科(中国)生物工程有限公司，江苏无锡 214028；2.丹尼斯克动物营养，广东广州 510620）

由于小麦、黑麦和燕麦等谷物饲料中含有较高含量的抗营养因子——阿拉伯木聚糖，因此，严重制约了这些谷物在动物饲料中的使用。如何有效降低抗营养因子对动物生产的影响越来越受到人们的关注。随着生物技术的不断发展，人们逐渐意识到在小麦基础饲粮中添加木聚糖酶，可有效降解饲料中的阿拉伯木聚糖，从而消除饲料原料中抗营养因子的不利效应[1-3]。通过补充外源的木聚糖酶，能够有效改善饲料的利用效率，提高动物的生产性能。目前，小麦基础饲粮中添加木聚糖酶已成为消除其抗营养因子对动物生产性能影响的常用方法[4]。然而，由于各种木聚糖酶来源不同，其生物学效价及稳定性也存在很大差异。此外，酶制剂随同食糜进入动物体内后，还面临着体内蛋白酶的分解作用，因此，在选择酶制剂时应该综合考虑各方面因素，选择生物学效价高、稳定性好的酶制剂，才能真正发挥酶制剂的生物学功效，从而有效改善动物的生产性能。本试验采用体外模拟胃肠道环境，研究不同来源木聚糖酶在模拟胃肠液中的稳定性，为木聚糖酶进一步在动物生产中的应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验所选8种木聚糖酶产品均来自市售不同木聚糖酶厂家产品，实测酶活性见表1。

表1 8种不同来源木聚糖酶的酶活(U/g)

1.2 试验试剂

1.2.1 G-con溶液

2 mg/ml NaCl，用HCl调pH值至2.0。

1.2.2 I-con溶液

0.05 M KH2PO4，用NaOH调pH值至6.8。

1.2.3 模拟胃液SGF[5]

3.8 mg胃蛋白酶(Sigma P6887)加到5 ml G-con溶液中，用HCl调pH值至2.0。

1.2.4 模拟肠液SIF[5]

10 mg胰蛋白酶(Sigma P1750)加到1 ml I-con溶液中，用NaOH调pH值至6.8。

1.2.5 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液

溶解10.19 g的单水柠檬酸(国药)和18.33 g的二水合磷酸氢二钠(国药)于1 000 ml蒸馏水中。测pH值，如果需要，调pH值至5.00。2～5℃储存1个月。

另外，玻璃滤纸ADVANTEC（GA-55）。

1.3 试验方法

1.3.1 对照试验

准确称取一定重量(记下重量)的酶样品，使其在加入50 ml柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液后的滤液浓度约为300 U/ml，加入50 ml柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，加入磁力搅拌转子搅拌30 min后，用玻璃滤纸过滤得到滤液。

9.5 ml柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液与0.5 ml处理后的酶液混合，此时计为0 h，开始计时，在1、2、3 h取样测定木聚糖酶酶活。

1.3.2 模拟胃液(SGF)对木聚糖酶酶活的影响

准确称取一定重量(记下重量)的酶样品，使其在加入50 ml柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液后的滤液浓度约为300 U/ml，加入50 ml柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，加入磁力搅拌转子搅拌30 min后，用玻璃滤纸过滤得到滤液。

9.5 ml SGF与0.5 ml处理后的酶液混合[6]，此时计为0 h，开始计时，在1、2、3 h取样测定木聚糖酶酶活。

1.3.3 模拟肠液(SIF)对木聚糖酶酶活的影响

准确称取一定重量(记下重量)的酶样品，使其在加入50 ml柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液后的滤液浓度约为300 U/ml，加入50 ml柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，加入磁力搅拌转子搅拌30 min后，用玻璃滤纸过滤得到滤液。

9.5 ml SIF与0.5 ml处理后的酶液混合[6]，此时计为0 h，开始计时，在1、2、3 h取样测定木聚糖酶酶活。

2 结果与讨论

2.1 缓冲液(Buffer)对木聚糖酶活性的影响(见图1)

饲用木聚糖酶作为一种生物催化活性蛋白，其酶活性会受到环境pH值的影响。这主要是由于酶的催化活性依赖于其质子移变基因在酶的活性位点上产生的静电荷数量；同时，pH值可以通过影响酶活性中心某些必须基团、辅酶及底物的解离状态以及水解反应过程中中间络合物的解离状态，进而影响酶活性部位与底物结合或催化的效率，抑制酶解产物的生成。只有当木聚糖酶的酶学特性（如温度、pH值等）与动物胃肠道生理特点相吻合时，才能充分发挥其催化活性。一般来讲，畜禽胃肠道前段主要呈偏酸性，后段则呈偏中性的环境；同时添加于饲料中的木聚糖酶在动物胃肠道内的生物催化作用是一个连续的过程，随着食糜向肠道后段的推移，其酶解作用的环境或条件（如：pH值、底物浓度及内源性蛋白酶等）均不断发生变化。其次，温度对酶蛋白的影响比较大，选择适宜的试验测定温度是必要的。在选择体外评估木聚糖酶的生物学功效时，其所选的处理温度应接近动物的体温[7]，因此，本试验选择37℃的温度条件下进行。试验结果表明，酶Ⅰ在缓冲液中的存留率最低，为85%，其余7种酶活均比较稳定，存留率均在90%以上。由此可见，在37℃条件下，在本试验中温度对8种木聚糖酶的活性影响不大。

图1 3 h内Buffer对8种酶存留率的影响(37℃恒温)

2.2 模拟胃液（SGF）对木聚糖酶酶活的影响（见图2）

图2 3 h内SGF对8种酶存留率的影响(37℃恒温)

由于动物胃内的pH值较低，约为2.5左右,过酸的pH值环境会明显降低酶的活性，且这种活性损失是不可逆的，因此酶在经过胃内酸性环境的作用下，其酶活性会有较大损失，从而影响了其在后肠道内的继续酶解作用；在选择酶制剂时，要选择的木聚糖酶对酸性环境一定要有较好的耐受性，在经过胃到达后肠道时，其仍具有良好的生物催化活性。除此之外，酶本身也是一种蛋白质，添加于饲料中的木聚糖酶在随着食糜一起经过动物的胃肠道时，体内胃蛋白酶水解作用可能会破坏木聚糖酶的活性。同时，不同来源的木聚糖酶对蛋白酶的抵抗力也有一定的差异。因此，饲用木聚糖酶对胃蛋白酶的耐受性也是评价其饲用价值的重要指标之一。本试验结果表明，在模拟胃液(SGF)中，酶Ⅰ中木聚糖酶的活性影响最大，酶活存留率最低，仅为4%，酶活基本完全损失；在胃内酶活存留率最高的为酶Ⅳ、酶Ⅶ和酶Ⅷ。由此可见，酶Ⅳ、酶Ⅶ和酶Ⅷ对酸性环境和胃蛋白酶具有较高的耐受性，在胃环境中能够保持很高的活性，在经过胃内酸性的消化阶段到达后肠道时，仍具有良好的生物催化活性。

2.3 模拟肠液(SIF)对木聚糖酶酶活的影响(见图3)

图3 3 h内SIF对8种酶存留率的影响(37℃恒温)

随着食糜向肠道后段的推移，其酶解作用的环境条件也随之发生变化，动物小肠中的pH值约为7.5左右，随同食糜一起进入肠道中的酶不但要面临酸度的变化，而且还要面临蛋白酶的降解作用。因此，所选的酶制剂一定要能够耐受pH值变化和蛋白酶的降解作用，才能使酶制剂在动物胃肠道中保持较高的活性，发挥其功效。本试验用体外法模拟动物肠道中的环境，研究模拟肠液对不同来源木聚糖酶的影响。结果表明，在37℃温度条件下，在模拟肠液中酶Ⅳ的耐受性最差，经过3 h处理后，酶活存留率仅为44%，酶Ⅰ的耐受性最好，存留率高达99%，酶活基本没有损失。由此可见，不同来源木聚糖酶对模拟肠液的耐受性不同。这可能是由于肠液中pH值和蛋白酶的影响所致，肠液中环境的变化，严重影响了酶制剂的生物学功效，因此，在动物饲料中选择使用酶制剂时应该综合考虑各项指标，确保酶制剂能够真正发挥其生物学功效，有效降解底物，改善营养物质的消化吸收，提高动物生产性能。

3 结论

在模拟胃液中，耐受性最好的是酶Ⅳ、酶Ⅶ和酶Ⅷ，耐受性最差的为酶Ⅰ；在模拟肠液中，耐受性最好的是酶Ⅰ，耐受性最差的为酶Ⅳ。

酶Ⅲ的初始酶活最高为26 318 U/g,但在模拟胃液中和肠液中的存留率分别为32%和84%，均不是最高，由此可见木聚糖酶的耐受性与自身的酶活大小不成正比。