Akt基因对肌肉细胞发育的表观调控

侯伟媛，张云生，牛华锋，辛亚平

（1.西安市灞桥区动物卫生监督所，陕西 西安710024；2.新疆农垦科学院 畜牧兽医研究所，新疆 石河子832000；3.杨凌职业技术学院，陕西 杨凌712100；4.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌712100）

Akt是真核细胞中非常重要的丝／苏氨酸蛋白激酶，在细胞生长、增殖、分化、代谢和细胞运动方面都有重要作用。在肌肉发育过程中，Akt可以促进成肌细胞增殖和分化。马血清诱导C2C12分化模型中，Akt对维持肌管细胞存活，刺激肌管形成都有重要作用，Akt还能够调控成熟肌管的数量和大小等。本文从Akt结构与功能、Akt调控成肌细胞增殖与分化、Akt调控表观修饰、肌细胞分化与组蛋白甲基化、Akt调控成肌细胞基因表达、问题与展望等方面论述了Akt基因对肌肉细胞发育的表观调控，以期为畜禽肌肉发育和分化研究提供依据。

1 Akt结构与功能

Akt／PKB是由480个氨基酸残基组成，分子量约60 KD的丝／苏氨酸激酶，与蛋白激酶A（PKA）和蛋白激酶C（PKC）分别具有65%和77%的序列同源性。哺乳动物有3种Akt的同源基因，Akt1／PKBα、Akt2／PKBβ和Akt3／PKBγ，三者基因序列同源性超过85%，并具有相似的蛋白结构，即位于N端PH结构域，中部催化结构域，以及C端调节域三部分组成。Akt1在大部分组织中都有表达；Akt2主要在胰岛素效应组织，如骨骼肌、肝、肾和心脏中表达；Akt3则在睾丸和脑组织中高表达［1］。

磷酸化是Akt激活的主要方式，其活性调节主要依赖于磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）和磷酸肌醇依赖性激酶（PDK）信号通路。Akt具有两个磷酸化调控修饰的活性位点（Thr308和Ser473），分别位于催化结构域和调节结构域，该位点被磷酸化后Akt才能达到充分活化状态。激活的Akt被转位到胞质或胞核，催化蛋白底物特定部位丝氨酸、苏氨酸残基的磷酸化，从而完成对胞内外信号刺激的应答［2］。

Akt1基因敲除小鼠，胚胎中后期和出生后3 d内容易致死，出生时体重比野生型小鼠约低20%，存活个体则表现出明显生长缺陷［3］。Akt2基因敲除小鼠，呈现典型Ⅱ型糖尿病表型，即高血糖、高胰岛素血症和葡萄糖耐受降低，胰岛素抑制肝脏产糖的能力减弱［4］。Akt3基因敲除小鼠，脑体积变小［5］。小鼠Akt1和Akt2同时缺失，会导致严重发育不全，组织和器官发育缺陷，表明Akt1和Akt2在发育中具有重要作用［6］。

2 Akt活化

在胰岛素、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNFα）等作用下，PI3K能够介导PKB的激活。PI3K是由85KD的调节亚基和110KD的催化亚基组成的异源二聚体。调节亚基P85具有1个SH3结构域；2个富含脯氨酸的结构域和2个Src同源结构域（Src homology domain 2，SH2）［7］。

当细胞表面受体被活化后，PI3K在细胞膜上催化产生3，4二磷酸磷脂酰肌醇（PI-3，4-P2）和3，4，5三磷酸磷脂酰肌醇（PI-3，4，5-P3）。二磷酸磷脂酰肌醇能够催化Akt产生同源二聚体，使部分Akt磷酸化。同时，在3、4、5三磷酸磷脂酰肌醇和p H结构域共同作用下，Akt能够与细胞膜结合，使更多的二聚体Akt被磷酸化，活化的Akt从细胞膜上解离下来［8］，并向细胞质或细胞核特定区域转运，与相应部位的底物蛋白相互作用，将底物蛋白特异位点的丝、苏氨酸磷酸化，从而使细胞信号继续传递，并产生特定的细胞响应。

3 Akt调控成肌细胞增殖与分化

体外培养的成肌细胞诱导分化时，Akt2表达升高，而Akt1保持不变。Akt1和Akt2在维持成肌细胞存活、再生和肥大方面，各自具体功能还不清楚。

3.1 Akt功能与成肌细胞

在成肌细胞和肌管细胞中，Akt1和Akt2都有表达，在分化细胞中，只有Akt2存在于核中［9］。当成肌细胞分化时，异源表达Akt1可有效抑制MCK转录，而Myogenin基因转录不受影响。异源表达Akt2会增加MCK和Myogenin基因转录，表明Akt2能够促进成肌细胞分化。不管是野生型或激活型，Akt2促进肌肉特异基因的转录效率都要高于Akt1，向细胞内注入Akt2的抗体，能够抑制肌细胞分化，注入Akt1的抗体则没有此作用［9］。

siRNA分别干扰Akt1和Akt2，只有当Akt2被干扰时，将会阻止成肌细胞退出细胞周期和抑制分化。Akt2过表达后，将增加成肌细胞分化为肌管的比例，MyoD过表达诱导成纤维细胞向肌细胞转化，需要Akt2参与。注入Akt1抗体，可阻止肌细胞或非肌细胞正常细胞周期进程，而注入Akt2抗体并没有同样的效果。沉默Akt1后，引起细胞周期蛋白A表达降低，阻止细胞进入S期；相反Akt2缺失后，会阻止细胞退出细胞周期，细胞周期蛋白A表达水平不变。过表达Akt2，细胞周期蛋白A表达会减少，阻止细胞从M期到G1期，并伴随核内p21增加［10］。

虽然很多研究表明，Akt2对成肌细胞分化有重要作用，但也有报道称Akt1能够调控肌细胞分化，而Akt2则不能。表达结构域失活的Akt1对细胞存活和增殖没有影响，但是可以通过沉默MyoD转录，阻止MyoD诱导的肌细胞分化，而干扰Akt2则不影响细胞的存活、增殖以及MyoD的转录［11］。

3.2 Akt功能与肌细胞代谢调控

在调控代谢方面，Akt1和Akt2也具有不同作用，IRS-1／Akt2对成肌细胞分化和葡萄糖代谢是必需的；而IRS-2／Akt1通路在脂代谢方面有重要作用。表达激活型的Akt1或Akt2，会导致肌纤维肥大、p70S6激酶磷酸化和糖原增加60%。Akt1能够增加糖原合成酶（GSK）磷酸化。Akt2能够增加葡萄糖吸收，沉默Akt2会引起糖原贮存和葡萄糖吸收减少，说明Akt2对葡萄糖转运有重要作用［12］。

4 Akt调控表观修饰

4.1 Akt调控DNA甲基转移酶

对人17种细胞系和27份膀胱癌组织检测发现，p-Akt磷酸化修饰与DNA甲基转移酶（Dnmt1）蛋白表达水平呈正相关。进一步分析表明，Akt在转录水平对Dnmt1无调控作用，但可以增加Dnmt1的蛋白稳定性，从而上调Dnmt1蛋白水平，维持DNA甲基化和染色质结构稳定性。IL-6处理细胞后发现，Akt能够磷酸化Dnmt1核定位信号肽，激活Dnmt1从胞质向核内转运［13］。

4.2 Akt调控组蛋白甲基转移酶

IGF-1／PI3K／Akt信号通路能够在染色质水平调控成肌细胞分化。添加PI3K特异性抑制剂，肌肉分化特异基因，如MCK和Myogenin，启动子区H3K27me3修饰水平升高。Akt能够磷酸化H3K27甲基转移酶Ezh2第21位丝氨酸残基，降低Ezh2与组蛋白H3结合能力，减弱催化甲基化生成的能力，H3K27me3水平减少。

酵母双杂试验发现，组蛋白H3K9甲基转移酶SETDB1与Akt1有直接相互作用，但Akt并不磷酸化SETDB1。NGF处理PC细胞12 h后，染色质H3K9me3修饰水平下降，H3K9乙酰化水平升高，此过程中表观修饰变化与NGF诱导基因的转录活性具有一致性［14］。

5 肌细胞分化与组蛋白甲基化

在细胞发育和分化过程中，组蛋白甲基化修饰能够响应细胞内外信号刺激，发生动态改变，参与基因表达调控。H3K27甲基化做为重要的组蛋白修饰形式，能够调控肌肉分化特异基因表达，使肌细胞分化以及肌管形成顺利进行。

ES细胞全基因组水平组蛋白修饰分析表明，部分基因转录起始区同时存在H3K4me3和H3K27me3双重修饰，基因呈低水平表达，这种修饰方式多位于重要转录因子和信号通路基因的启动子区，在终未分化的细胞中也发现有双重修饰现象。当Ca2＋诱导分化时，去甲基化酶Jmjd3与表皮细胞分化相关基因启动子区结合增加，H3K27me3和PcG被去除。表皮组织中失活Jmjd3，会阻止分化；激活Jmjd3，将诱导分化，表明Jmjd3能够调控H3K27甲基化水平，促进哺乳动物表皮分化［15］。

成肌细胞分化时，抑制型的H3K27甲基化修饰将首先被去除，然后再募集转录激活因子到基因组特定区域，激活肌肉分化相关基因转录，促进肌肉特异基因表达和肌细胞分化。H3K27甲基转移酶Ezh2能够调控肌肉特异性基因表达，使肌肉发育和分化正常进行。当成肌细胞被诱导分化后，Ezh2表达下调，肌肉特异基因启动子区H3K27甲基化水平降低，激活分化特异基因表达，促进成肌细胞分化顺利进行，而过表达Ezh2将抑制肌肉分化，表明Ezh2能够通过甲基转移酶活性抑制肌肉分化［16］。H3K9甲基转移酶Suv39h1能够抑制肌肉特异基因表达，使肌细胞保持增殖状态，过表达Suv39h1，能抑制依赖MyoD转录的肌肉特异基因的表达。此作用需Suv39h1结合MyoD，维持Myogenin启动子区H3K9甲基化修饰。Suv39h1和MyoD是否结合于肌肉特异抑制基因的启动子区，是肌细胞最终会发生增殖或分化的决定因素［17］。

6 Akt调控成肌细胞基因表达

NF-κB不仅能够调节先天免疫和细胞存活，而且在皮肤、肌肉分化过程中也具有重要作用。在成肌细胞分化过程中，p38和NF-κB可以诱导IL-6表达。干扰IL-6会减弱成肌细胞分化，而过表达IL-6会促进分化作用，添加IL-6后，可以补救由于NF-κB抑制所引起的肌肉分化抑制现象。在增殖情况下，成肌细胞失去NF-κB的作用，将会检测到肌纤维基因的表达，说明肌细胞分化后期NF-κB对肌肉特异基因表达有负调节作用［11］。尽管预测几种肌纤维基因的启动子区含有NF-κB结合位点，研究表明NF-κB抑制基因表达，并不是直接与DNA结合，NF-κB可以在转录水平上增加YY1基因表达，从而抑制肌肉特异基因转录，调控成肌细胞分化［18］。

7 小 结

Akt是细胞内重要的丝／苏氨酸蛋白激酶，具有多种作用底物，能够在基因表达和表观修饰等多个层次上参与细胞功能调控。在肌细胞分化过程中，表观修饰如DNA甲基化、组蛋修饰和染色质重塑，都发生了很明显的变化，并受到精确调控。成肌细胞是研究肌肉发育、分化最重要的细胞模型，多种肌肉特异性调控基因被发现和鉴定，表观调控将成为研究肌肉发育和分化的重要内容。

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