中医药干预脊髓损伤后基因表达实验研究进展

王雨辰,马 勇

(南京中医药大学,江苏南京210046)

脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是指因直接暴力或间接暴力作用在正常脊柱和脊髓组织,致损伤平面以下脊髓各项功能,包括运动、感觉、括约肌和反射功能障碍。脊髓损伤对个人及社会带来巨大的负担,所以研究脊髓损伤的治疗具有十分重要的意义。西药治疗主要是皮质类固醇、鸦片对抗剂、利尿剂等。近年来,中医药实验干预脊髓损伤是以抑制神经细胞凋亡和促进再生为主要研究方向。文章就近年来中医药在干预脊髓损伤后基因表达方面的基础实验研究做一概述,为今后的中医药治疗脊髓损伤的研究提供参考。

1 SCI模型

SCI模型有挫伤型模型、气囊压迫型模型、切割型模型、光化学诱导型模型、牵拉型模型等,而压迫型与挫伤型模型可较准确地模拟临床SCI病理表现,并很好地呈现SCI继发性损伤的病理变化[1]。

急性脊髓损伤模型较多采用挫伤型模型,即使用改良的Allen重物打击法造模,王健等[2]人对分组后的SD大鼠称重,以2%戊巴比妥钠按30 mg/kg麻醉,消毒后以T10棘突为中心取背部后正中纵行切口。将长10 mm,宽2 mm,厚1 mm的塑料垫片按大鼠脊髓背侧生理曲度屈曲预弯后,小心放置于T10处脊髓硬脊膜外,将特制的套筒嘴垂直轻放于塑料垫片正中心上,用改良Allen氏打击装置,以50 gcf(冲击量为5 g重物从10 cm高度自由落下)致伤能量强度的重力打击脊髓,以观察到鼠尾痉挛性摆动,双下肢及躯体回缩扑动,示建模成功。

实验动物常选用SD大鼠、Wistar大鼠,也有少数实验使用恒河猴或新西兰大白兔。给药方法:中药提取物多用腹腔注射或静脉注射,复方多采用灌喂方式,针灸主要是特定穴位进行电刺激。

2 中医药干预SCI后基因表达的实验研究

2.1 B细胞淋巴瘤/白血病基因-2(B-cell lymphoma/leukemia 2,Bcl-2)基因家族 现代研究[3]表明Bcl-2能够阻止或减缓多种类型细胞的凋亡。罗春山等[4]在造模(加速压迫型Allen's打击法造模)前后对SD大鼠静注汉防己甲素和甲基强的松龙。免疫组化结果:汉防己甲素和甲基强的松龙可以明显促进脊髓细胞Bcl-2的表达同时抑制Bax的表达,而两组间在Bcl-2和Bax表达上差异无统计学意义,表明汉防己甲素在抑制神经细胞凋亡方面与甲基强的松龙作用相似。井晓磊等[5]用女贞子液治疗SCI造模大鼠,结果显示女贞子液可以明显增强脊髓Bcl-2表达,减弱Bax表达。宋永兴等[6]用Western blot方法检测人参皂苷治疗SCI大鼠后bcl-2和bax的表达,结果示各时间段大鼠脊髓中Bcl-2蛋白表达均高于损伤组(P<0.01),bax蛋白均低于损伤组(P<0.05或P<0.01),表明人参皂苷能够明显增加脊髓细胞Bcl-2表达,抑制bax的表达。杜长青等[7]使用中药髓复康(生黄芪、川芎、赤芍、红花、葛根和三七等 8味中草药)灌喂脊髓半横断后的恒河猴,结果表明髓复康可以明显促进Bcl-2蛋白表达,抑制Bax蛋白表达和脊髓神经元凋亡。素问《骨空论》云:“督脉者,贯脊,属肾”,针刺督脉直达病所,可以活血祛瘀、温阳通督,从而使经气上下贯通起作用,阳气通达,筋脉得以濡养[8]。现代研究表明电针可以阻止脊髓继发性损伤、促进轴突再生、促进神经干细胞增殖[9]。李晓宁等[10]采用夹脊电针治疗SCI大鼠,并使用原位杂交法观察SCI后bcl-2mRNA的表达,结果显示随着电针治疗时间的增加,电针密波组bcl-2mRNA的表达逐渐优于模型组和地塞米松组,14 d时达到高峰(P<0.01),夹脊电针通过提高bcl-2mRNA的表达来抑制脊髓损伤早期细胞凋亡,对脊髓功能的恢复起着重要作用。

2.2 半胱氨酸基天冬氨酸-特异性蛋白酶(caspase,cysteine-aspartic proteases)基因家族 caspase基因家族大部分成员都参与了细胞凋亡,其作用过程涉及的因素及信号传导途径非常复杂。其中Caspase-3被认为是凋亡过程最重要的蛋白酶[11],Caspase-3介导的神经细胞凋亡会导致脊髓继发性损伤[12]。王健等[2]应用RT-PCR检测川芎嗪对大鼠急性脊髓损伤后caspase-3mRNA表达的影响,结果发现应用川芎嗪和甲强龙后各时间点caspase-3mRNA的表达量下降,治疗后caspase-3mRNA表达呈现下降的趋势同甲强龙组接近。李晓宁等[13]采用电针刺激“心俞、脾俞”等穴位的方法治疗大鼠脊髓损伤,免疫组化法检测Caspase-9证实电针可以抑制Caspase-9在大鼠脊髓损伤神经元中表达。

2.3 热休克蛋白(heat shock protein,HSP)基因家族HSP基因家族的作用机制很复杂,它们中既有促炎症效应的因子,也有具备抗炎症及细胞保护的双重作用的因子[14]。胶质瘢痕是SCI修复的阻碍因素之一[15],热休克蛋白47(HSP47)在瘢痕纤维化的形成过程中起重要作用。何玉宝等[16]对钳夹型SCI大鼠模型给予腹腔注射苦参素。结果:GFAP和HSP47表达降低,说明苦参素通过干预HSP47的表达阻止胶质瘢痕形成,对脊髓细胞起到保护作用。HSP70可通过抑制caspase-8的激活,减少凋亡,达到保护细胞的作用[17]。HSP70可通过抑制JNK3的激活,进而阻止Bax进入线粒体;亦可直接抑制Bid的活化,阻断其后的凋亡通路[18]。徐维蓉等[19]采用督脉电针治疗大鼠脊髓损伤并使用免疫组化法观察HSP70的阳性表达,结果示电针治疗可以增加脊髓损伤大鼠脊髓损伤部HSP70及其mRNA的表达。

2.4 白介素家族(IL,interleukin) 最近研究[20]表明SCI后细胞外谷氨酸盐的升高能促进细胞的死亡和功能减退,而IL-1β介导了SCI后谷氨酸盐的损害作用。提示阻断IL-1β可能减轻脊髓继发性损伤。Fan L等[21]采用免疫组化的观察使用川芎嗪治疗缺血性脊髓损伤大鼠IL-10和IL-1β的表达情况,结果显示川芎嗪组较对照组IL-10明显上调,IL-1β表达明显减少。白细胞介素1(IL-1)是具有广泛生物学活性的多肽,IL-1α主要参与介导炎症反应、调节免疫及调节机体代谢,IL-1α表达减少提示炎症反应的减弱。张莹莹等[22]采用针刺并电刺激“夹脊穴”和“足三里”后观察IL-1α的表达情况,结果发现IL-1α阳性表达在伤后7 d内持续上升,伤后5 d、7 d,电刺激组IL-1α表达低于损伤组(P<0.05),这表明了针刺及电刺激可以抑制IL-1α的表达,有利于减轻脊髓炎症反应。

2.5 神经营养因子家族(neurotrophin families,NTFs)NTFs包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素3/4/5(NT3/4/5)、睫状神经营养因子(CNTF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)等,它们不仅能促进正常神经细胞的生长发育,而且对损伤的神经元有预防退变和促进再生的作用。李花等[23]发现利用三七总皂苷干预脊髓全横断大鼠,观察脑源性神经营养因子(BDNF)的表达较正常组增强,这表明三七总皂苷可能改善脊髓再生的微环境,促进脊髓损伤后运动功能恢复。杜旭等[24]取“大椎、命门”和“夹脊穴”两组穴位交替电针治疗治疗SCI大鼠,观察脑源性神经营养因子(BDNF)的免疫组化变化,结果显示BDNF在电针组和甲强龙组阳性细胞数显著强于模型对照组和空白对照组。组间没有显著性差异(P>0.05),表明电针治疗可明显增强SCI后BDNF的表达,促进SCI后神经的修复与再生。陈虹等[25]发现经皮电刺激“夹脊穴”及“足三里”治疗脊髓损伤大鼠,能够促进脊髓灰质神经元神经生长因子(NGF)的表达。

3 小结

综上所述,中医药是具有千年历史的传统医学,博大精深,同西医治疗相比,中医药治疗具有自身优势,通常存在剂型丰富、方法多样、多系统多靶点的作用。相比复方制剂而言,单味中药治疗及针灸电针更容易被实验者采纳,其在相关动物实验研究上取得的成功亦为中医药治疗脊髓损伤提供了更广阔的前景,如川芎(川芎嗪)目前发现其不但可以有效抑制模型大鼠caspase-3的表达[2],同时也可以有效增加IL-10的表达[21],从而对损伤脊髓起到保护作用。但中医药具体的作用机制尚不明确,相信随着分子生物学的深入研究,中医药保护神经细胞的机制将进一步阐明,将为脊髓损伤的治疗提供新的治疗思路和方法。

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