双歧杆菌发酵工艺研究进展

柳俊灵

（青岛科技大学,山东 青岛 266042）

双歧杆菌(Bifidobacterium)首次发现是由Henry Tissier于1899年从母乳喂养的婴儿粪便中分离得到[1]。双歧杆菌属于革兰氏阳性杆菌,对氧十分敏感，对低pH耐性差，极易失活，最适pH为6.5～7.0，最适生长温度37～42℃[2]。双歧杆菌能有效地维持肠道正常菌群平衡，同时对于抗腹泻、抗便秘、抗感染、抗肿瘤等方面也有独特的生理功能。双歧杆菌在生长过程中产生的维生素、氨基酸类营养物质能改善牛奶的营养价值，因此在牛奶生产中广泛应用[3]。但由于双歧杆菌对生长环境要求严格，致使在生产中菌株培养较困难，生产周期长，产品活菌数量少等问题。为解决这类问题，国内外学者对双歧杆菌培养条件和发酵工艺进行了广泛的研究报道。

1 培养基中各成分对双歧杆菌发酵的影响

1.1 碳源

通常用葡萄糖等单糖和低聚糖作为双歧杆菌生长的主要碳源。邵建宁等[4]通过改变碳源、pH和添加低聚糖研究其对长双歧杆菌生长的影响，得到最佳培养基，在此培养基中37℃培养20h后，菌落数达8.9×109cfu/mL，较基础培养基培养时间缩短4h，活菌数提高8.1倍。鹿晓菲等[5]研究出适合工业生产的低成本培养基，以废糖蜜、玉米浆代替培养基中的碳源、氮源，同时添加番茄汁、低聚果糖，经培养32h后，活菌数可达4.33×109cfu/mL，有较高的工业应用价值。

1.2 氮源

氮源主要是胰蛋白胨、蛋白胨、酵母提取物等。种克等[6]对双歧杆菌麦芽复合汁增菌培养基进行研究，结果表明大豆蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米浆可显著促进两岐双歧杆菌增殖。酵母膏富含核苷酸、蛋白质，对活菌数有明显的影响，生产中缺少酵母膏菌体将停止生长。肖仔君等[7]报道了酵母膏对短双歧杆菌有较为显著的影响，在以TPY为基础培养基的优化培养基中培养18h后，菌数可达2.1×1010cfu/mL。王振国[8]对苦豆籽粕—双歧杆菌合生元进行了研究，结果表明在培养基中添加6%质量分数的苦豆籽粕对两歧双歧杆菌的体外生长有明显的促进作用，两歧双歧杆菌活菌数的数量级是对照组的1000倍。

1.3 生长因子对双歧杆菌的促生长作用

生长因子对双歧杆菌的增殖有显著作用。增殖因子主要包括低聚糖类双歧因子、蛋白质水解形成的肽类、天然植物及中草药提取物类等。

1.3.1 低聚糖类

低聚糖类是双歧因子的主要组成部分，目前常见的低聚糖主要有低聚木糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖、低聚半乳糖等20余种。项明洁[9]等研究了低聚果糖对双歧杆菌增殖效果及肠道菌群的影响，研究结果表明在厌氧液体培养基加入低聚果糖后双歧杆菌菌数由1.5×108cfu/mL增加到3×108cfu/mL。

1.3.2 蛋白质水解肽类产物

蛋白质水解肽类双歧因子主要有乳清蛋白、乳铁蛋白、酪蛋白水解物、胃粘膜蛋白水解物等。工业中常用的蛋白类双歧因子中增殖效果最为明显的是酵母浸提液，除此之外大豆胰蛋白酶水解物和牛肉浸膏在工业中应用也较为广泛。吴敏等[10]对影响婴儿双歧杆菌生长的双歧因子进行了研究，结果显示双歧因子对其活化的影响程度依次为酵母浸提液、酪蛋白胨、磷酸氢二钾。C.Janer[11]研究发现在牛乳培养基中添加2%酪蛋白时，双歧杆菌活菌数比对照组提高1.51g，而在添加2%的乳清蛋白的牛乳培养基中，双歧杆菌菌落数达到最高。研究发现这些物质对双歧杆菌的生长促进活性与它们的二硫键有密切关系。

1.3.3 天然植物及中草药浸提物

天然植物材料中，如番茄汁、胡萝卜汁、平菇汁、黄芪等均含有双歧杆菌需要的生长因子，一些中药浸提物如枸杞中也含有较为丰富的双歧因子。韩雪等[12]通过正交试验研究了4种天然提取物平菇汁、卷心菜汁、豆浆、胡萝卜汁对双歧杆菌增殖的效果，按最佳配比添加后双歧杆菌活菌数达2.58×109cfu/mL，较添加前增加2.95倍，。刘彦亮[13]研究了以黄芪浸提液为主要原料的黄芪复合增菌培养基，在优化培养基中培养双歧杆菌16h后，活菌数可达 4.59×109cfu/mL。Szilard Kun 等[14]研究表明胡萝卜汁对双歧杆菌的增菌效果显著，双歧杆菌在单一的胡萝卜汁中培养时菌落数可达108cfu/mL。

1.3.4 短链脂肪酸类和其它类

短链脂肪酸、乳酸菌素、稀土元素及无机盐离子等也是对双歧杆菌有增殖作用的双歧因子。张树和等[15]研究发现大豆多糖对双歧杆菌增菌效果明显与低聚果糖一致，具有益生元特性。郭思建等[16]发现乳酸菌素对双歧杆菌有很强的促生长作用，且双歧杆菌增菌效果与乳酸菌素浓度高低有密切关系，高浓度乳酸菌素液促进双歧杆菌生长效果较好。

2 发酵条件对双歧杆菌生长的影响

2.1 pH值

pH值影响反应液中物质的电荷状态，双歧杆菌细胞内酶氨基酸电离状态和细胞内酶的活性。舒国伟等[17]研究了pH值及接种量对两株两歧双歧杆菌BB01、BB03生长的影响。结果表明，BB01、BB03的最适生长pH分别为6.5和6.0。提高菌株的耐酸性具有工业应用价值，熊三玉等[18]通过反复驯化将两歧双歧杆菌驯化成耐氧耐酸耐胆盐的优良菌株，经过耐酸驯化的菌株在低pH值条件下的产酸性明显优于未经驯化的菌株。林娟等[19]采用驯化和紫外线诱变两种方法选育双歧杆菌耐酸耐氧菌株，与原始菌株相比，诱变株在pH4.5液体培养基中生长速度加快，衰亡速度减缓，在36h达最大活菌量，72h仍保持较高活菌量。

2.2 温度和接种量

温度和接种量在双歧杆菌发酵过程中是两个重要的因素。温度对菌体的生长和发酵的影响是各种因素综合表现的结果。适宜的温度对菌体的增殖和产物的产量的提高有较大的影响。鲍行豪等[20]研究了培养液预温对双歧杆菌生长的影响，结果表明预温后37℃培养20h即可达到菌体最高生物量，较预温前提前12h。接种量对双歧杆菌的生长也有一定影响，接种量增加，在相同时间内对活菌总数有一定影响，研究表明双歧杆菌培养最佳接种量为4%～5%。

2.3 氧

双歧杆菌对氧及其敏感，有氧条件下双歧杆菌会形成H2O2、O2-、HO·等活性氧，这些活性氧基团在细胞内积累会对细胞形成毒害作用。目前较多文献研究了氧对双歧杆菌生长的影响。据报道，氧气会影响双歧杆菌的糖代谢[21]。而双歧杆菌葡萄糖代谢酶的基因在环境胁迫下也发生表达量的变化[22，23]。赵建云等[24]采用半定量RT-PCR法对在4%氧气条件下培养的长双歧杆菌BBMN68的葡萄糖代谢中关键酶基因m RNA表达水平进行了比较。研究发现，随着氧气浓度增加，长双歧杆菌BBMN68的生长逐渐受到抑制，在氧质量分数为4%胁迫条件下，葡萄糖磷酸变位酶等多种酶在氧胁迫30min时的m RNA表达明显下降。基于双歧杆菌对氧要求严格的这一特性，使得其工业生产存在较多困难，如对生产设备要求较高、工艺过程较为繁琐等。

因此对菌株进行耐氧驯化或用基因技术获得耐氧菌株是解决这一问题的有效方法。如张莉滟[25]利用电场诱导原生质体融合的方法，融合了兼性厌氧菌保加利亚乳杆菌与长双歧杆菌，筛选得到的融合子具有一定的耐氧性。李青青[26]利用考察筛选了9株双歧杆菌的耐氧性，通过增加氧气浓度的方式进行复筛，得到的耐氧双歧杆菌能抵抗液体培养时氧气的摄入并能获得较高的生长量。鉴定得出该耐氧双歧杆菌为Bifidobacterium.animalis.subsp.lactis.

3 培养技术对双歧杆菌发酵的影响

常用的生产双歧杆菌的方法是分批培养，这种培养方法可造成底物耗尽和阻遏物的积累，使生物量和产物在培养后期不再增加呈稳定状态。为了解决分批培养出现的问题，现在研究的趋势是高密度培养方法（High cell-density culture）。常用的高密度培养方法有分批补料培养、过滤培养和连续培养等，下面就分批补料培养和连续培养做详细论述。

3.1 补料分批培养

补料分批技术解决了分批培养中底物的限制及产物的抑制。白文[27]研究了青春双歧杆菌补料高密度培养的方法，以青春双歧杆菌液体分批培养研究为基础，补加碱液调整发酵过程中培养基的pH，同时补加葡萄糖以消除碳源减少对双歧杆菌增殖的抑制，使发酵罐高密度培养对数期延长8h，最大活菌数由 3.9×108cfu/mL 提高到 4.6×109cfu/mL，实现了青春双歧杆菌的高密度培养。倪雪朋等[28]研究了不同培养技术对耐氧两歧双歧杆菌生长的影响，结果表明流加培养效果最好，小瓶培养、发酵罐间歇培养次之。流加培养可延长双歧杆菌生长周期，使双歧杆菌的OD值达到1.167，活菌数达2.87×1010cfu/mL，明显高于优化培养基。

3.2 连续培养

曹郁生等[29]研究了双歧杆菌厌氧连续培养的技术，连续培养方法较静置批量培养得到的活菌数高活力好，单位容积的产量高。通过控制连续培养系统pH值为6.0，采用不同稀释率检查其对培养物的影响，达到稳定时分析其活菌数量、乳酸和乙酸产量。结果表明当稀释率为0.064h-1时，培养液中的活菌数达5.2×108cfu/mL。

4 发展与展望

21世纪功能性食品是食品发展的主流，满足不同人群需要的特殊营养品已成为我国食品工业的发展重点，而双歧杆菌的功能性恰好适合这一趋势。目前对于双歧杆菌在微生态制剂、功能性食品和药品等方面的研究越来越多。因此优化双歧杆菌发酵工艺，实现大规模工业化生产意义重大。

目前对于双歧杆菌的研究在优良菌株选育、耐氧驯化、冷冻干燥、微囊化等方面取得了一定的成果，解决了菌株高密度高活性培养的困难，以及对生产设备要求严格、不耐受胃酸等问题，为该菌的实际工业应用提供了保障和可能。但鉴于双歧杆菌本身固有的生理特点，目前我们还没有完全掌握双歧杆菌的特性，产品常温下保存的稳定性也有待提高。除此之外我们还需要通过控制发酵过程逐渐完善高密度发酵；通过完善发酵设备更好地监测菌株生长状态；结合发酵工艺，简化操作工艺、降低成本实现双歧杆菌生产的规模化产业化。

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