Otoferlin蛋白与听毛细胞突触传导＊

郭旭尧 综述 袁伟 张学渊 审校

在哺乳动物中，耳蜗基底膜突触囊泡是听觉感知的重要部分，它通过纤毛细胞机械传导，调节Ca2＋通道的Ca2＋内流从而刺激递质释放传入感觉中枢。为了维持适当的Ca2＋浓度，体内系统会产生多种多样的功能蛋白：比如感觉神经系统中的Ca2＋“传感器”—海马钙蛋白（hippocalcin）、视锥蛋白（visinin）和恢复蛋白（recoverin）。近年来，在耳蜗听毛细胞中，发现了一种新的蛋白质—Otoferlin，其分子量约230kDa，可能在听毛细胞中充当着Ca2＋“传感器”的角色，并且对维持正常听力起重要作用。本文就Otoferlin蛋白在耳蜗听毛细胞突触囊泡中的功能进行综述。

1 Otoferlin蛋白的结构

Otoferlin蛋白是由OTOF 基因最长亚型编码的一种特殊蛋白质，存在6个Ca2＋结合区域—C（2）区域，其中4个含有完整的5个天冬氨酸残基，可以和Ca2＋结合；这个最长亚型包含48个外显子，其中外显子1未被编码，编码长度为1 997个氨基酸的类ferlin蛋白Otoferlin［1～3］；并且它的Ca2＋结合区域还可以与胞浆磷脂酶A2、突触结合蛋白I（synaptotagmin I）、Ras相关的GTP 结合蛋白等结合，在细胞膜运输、信号传导及神经递质释放等方面起着重要作用［4］。OTOF 基因家族有两个亚型：一种含有DysF，一种缺失DysF。无脊椎动物通常只有两个OTOF基因（1个含有DysF和1个缺失DysF），大多数的脊椎动物含有6个OTOF 基因（3个含有DysF和3个缺失DysF）。几乎所有的Otoferlin蛋白都含有1个N－terminalC2－FerI－C2“三明治”样结构、1个FerB基因序列和2个毗邻的C－末端C（2）跨膜结构区域［C（2）E 和C（2）F］，它们是保持Otoferlin蛋白功能的基本结构；而DysF、C（2）E和FerA 是可以选择的，属于OTOF 基因的结构拓展域，它们缺失也能保持Otoferlin蛋白的基本功能［5］。通过以甘氨酸、天冬氨酸代替Otoferlin蛋白Ca2＋结合区域的C（2）F结构域试验，证明Otoferlin蛋白的C（2）F是Ca2＋结合至关重要的结构域，对带状突触囊泡的融合起至关重要的作用［6］。重组蛋白质研究发现Otoferlin蛋白6个C（2）区域中的5个能感受Ca2＋，在膜表面亲和力高达7倍，其解离常数达到13～25uM；重组膜融合试验发现这5个C（2）区域能刺激激活Ca2＋依赖性的膜融合，同时还发现C（2）C 区域不能结合Ca2＋，不能刺激膜融合［7］。在1.95－A 分辨率下发现Otoferlin蛋白的C（2）钙离子结合区域N 末端晶体结构C2－A，这个C（2）区域拥有完整的8个β－折叠，并且与突触结合蛋白、蛋白激酶C 亚型和磷脂酶类序列有点类似，而且它的顶部环状结构相比Otoferlin的其他C（2）区域显著缩短。C2－A 这个带正电荷的C（2）区域与其它典型的C（2）区域顶部围绕的带有负电荷的“颈”状隆起不一样，C2－A 这个C（2）区域不能结合Ca2＋，而且也不能结合磷脂膜，因此，其它没有带正电荷的β－折叠C（2）区域才能结合磷脂酰肌醇－4，5－二磷酸［8］。

2 Otoferlin蛋白的表达

利用免疫组织化学法和原位杂交的方法发现Otoferlin蛋白在Wistar大鼠的耳蜗、前庭、耳蜗螺旋神经节、前庭神经核、小脑、海马回和睾丸均有表达［9］。在未成熟的小鼠耳蜗中Otoferlin蛋白主要表达在内毛细胞，在外毛细胞和螺旋神经节细胞着色较浅，在球囊、椭圆囊、半规管的神经纤维及前庭神经元I型细胞上也有表达；但是Otoferlin蛋白在成年小鼠耳蜗中仅在内毛细胞高度表达，而支持细胞上没有表达，并且集中表达于内毛细胞基底膜外侧，而内毛细胞也正是在此处与传入神经元的树突形成独特的带状突触进行信号传导，同时利用免疫组化染色和胶体金技术在小鼠耳蜗切片标记中发现，55%的Otoferlin颗粒位于带状突触附近，其中21%位于突触前膜上，4%位于突触部位附近胞质中［10］。在Otoferlin蛋白中鉴定出一种单克隆抗体HCS－1（hair cell soma－1），其在带状突触免疫染色不集中，推测Otoferlin蛋白除了在听毛细胞传入突触囊泡胞吐释放发挥作用外可能还有其他的功能，同时还发现Otoferlin蛋白主要分布在内毛细胞基底膜外侧和带状突触囊泡胞浆中，它紧密附着在基底膜上，是一种不溶性钙盐浓缩物［11］。

3 Otoferlin蛋白在听毛细胞突触传导中的功能

Otoferlin蛋白在耳蜗的表达与内毛细胞传入神经突触之间有显著的关联，这意味着Otoferlin蛋白可能是内毛细胞突触前膜结构的重要组成部分，因此推测Otoferlin蛋白是一种含有Ca2＋结合区域的跨膜功能蛋白，充当着Ca2＋“传感器”的角色，在内毛细胞带状突触前膜融合，从而对内毛细胞传入突触囊泡的分泌发挥着重要作用［12］。实验发现OTOF基因敲除纯合子小鼠表现为极重度聋，听性脑干反应（ABR）不能引出，其内毛细胞与传入神经元所形成的带状突触形态正常，Ca2＋的流通也正常，但是突触囊泡的分泌作用却完全停止［10］。关于它是如何在带状突触前膜融合的，Roberts［13］提出如下假说：Otoferlin蛋白开始主要集中在突触带周围的突触囊泡胞浆中，Ca2＋内流与其结合，定向释放到突触前膜的结合位点，激活预先固定在结合位点的SNARE蛋白复合体（syntaxin－1A 和SNAP－25），然后促使突触囊泡与质膜紧密融合并释放神经递质。

听毛细胞突触结合蛋白复合体中有两种主要SNARE靶蛋白：syntaxin－1A 和SNAP－25，他们与Otoferlin蛋白相互作用；同时发现Otoferlin的Ca2＋结合区域C（2）F与C（2）D 是Ca2＋结合最重要结构域，SNARE 蛋白复合体主要结合在C（2）F（P1825A）结构域［14］。实验发现通过突变Ca2＋结合区域改变Otoferlin结合syntaxin－1A 和SNAP－25能力，改变Cav1.3通道Ca2＋流通效率，可以间接调节Otoferlin对突触囊泡分泌释放而影响内毛细胞的功能。为了解耳蜗内毛细胞囊泡分泌过程中Otoferlin与突触结合蛋白之间的关系，Beurg等［15］通过测量出生4 天的鼠内毛细胞电容，发现其是Ca2＋依赖性分泌，Otoferlin可能是构成Ca2＋依赖性膜融合的基础功能蛋白，是增加内毛细胞带状突触囊泡融合概率和同步性的必要蛋白；早期分泌物中检测到Sty1、Sty2、Sty7几种突触结合蛋白，Sty1和Sty2这两种中枢神经系统突触中常见的Ca2＋“传感器”在成熟内毛细胞中没有表达［15］。通过比较内毛细胞、肾上腺嗜铬细胞和海马神经元三种细胞分泌模型系统中Otoferlin和Sty1的功能发现，将Sty1基因异位表达于OTOF 敲除小鼠培养的胚胎内耳器官中，没有激活它的Ca2＋依赖性分泌，Otoferlin蛋白过度表达于敲除Sty1的嗜铬细胞和海马神经元，也没有恢复局部分泌，但是增强了海马神经元的递质释放［16］。之后Pangrsic等［17］提出假说：Otoferlin蛋白与快相释放囊泡（RRP）补充融合关系密切。他们在DFNB9耳聋鼠的模型中发现，用天冬氨酸和甘氨酸突变代替Otoferlin 蛋白C（2）F 区域，评估其RRP、Ca2＋信号和囊泡的功能，加入突触后电流的大小变量和波峰值测试，发现突变型小鼠比野生型小鼠快相释放囊泡RRP 恢复补充减少且速度缓慢。

然而并不只有syntaxin－1A、2A 和SNAP－25是与Otoferlin相互作用的蛋白质，有研究显示除了突触结合蛋白－1和突触结合蛋白－2这两种经典的突触融合蛋白外，通过酵母菌双杂交技术发现了一种新的与Otoferlin 有关的蛋白myosinVI，通过免疫共沉淀法发现内毛细胞基底膜外侧Otoferlin和myosinVI两种相互作用蛋白，通过比较两种蛋白质的突变体发现，两种蛋白质对突触成熟起到了互补作用：①内毛细胞Otoferlin突变的小鼠其Cav1.3通道Ca2＋生物电活动严重减退，CtBP2／RIBEYE标记的突触囊泡分泌作用严重下降；②内毛细胞myosinVI突变的小鼠其耳蜗顶回毛细胞区域的膜BK＋通道生物电活动衰退，Ca2＋依赖性分泌效率下降；③内毛细胞两种蛋白突变的小鼠显示出标记的突触蛋白数量减少和形态改变［18，19］。

Engel等［20］对外毛细胞Ca2＋相关通道功能研究发现，耳蜗低频区外毛细胞Ca2＋通道在敲除Otoferlin 蛋白后的反应比高频区外毛细胞敏感。Beurg等［21］通过研究动物未成熟外毛细胞的Ca2＋通道和Otoferlin蛋白相关的分泌作用发现，新生小鼠敲除OTOF 基因后，其不成熟的外毛细胞Ca2＋通道生物电活动正常，但是突触囊泡的分泌作用却完全停止。Johnso等［22］利用Ca2＋试剂盒和全细胞膜片钳技术，精确检测未成熟沙鼠毛细胞膜电容变化，间接地反映突触囊泡分泌作用，提出Otoferlin蛋白不论是在内毛细胞的高Ca2＋依赖性的突触囊泡分泌作用，还是在与外毛细胞Ca2＋的线性关系上，都是作为耳蜗毛细胞Ca2＋“传感器”而影响着听神经带状突触囊泡的膜融合和分泌释放。因此，Otoferlin蛋白不仅在毛细胞Ca2＋通道活动中起到至关重要的作用，可能同样作用于未成熟的外毛细胞Ca2＋通道。

Brandt等［23］的研究表明甲状腺激素可以调控未成熟毛细胞Ca2＋和K＋通道活动，他们质疑Otoferlin蛋白是毛细胞突触囊泡分泌作用的必需蛋白质。Schuowatzki等［24］提出OTOF 基因敲除的动物，突触活动仍然存在，只是膜电容测量显示突触囊泡融合减少。而且，还发现Otoferlin不仅通过结合SNARE蛋白复合体和Ca2＋的方式参与带状突触囊泡的融合及神经递质释放，也可以通过和Rab8b鸟苷酸三磷酸酶共同作用参与跨高尔基体的运输过程［25］。在小鼠的一些非神经组织内也见到了Otoferlin蛋白的阳性表达，说明Otoferlin蛋白可能并不是唯一与Ca2＋通道活动相关的蛋白质，可能也参与了其它一些细胞的运输过程［1］。

4 Otoferlin蛋白的研究前景

虽然目前关于Otoferlin蛋白的结构、表达和功能研究取得了一定的进展，然而目前关于听毛细胞中Otoferlin蛋白作为Ca2＋“传感器”控制Ca2＋依赖性的突触囊泡分泌释放还存在几个疑问：①免疫组织化学和mRNA 检测指出Otoferlin广泛分布于中枢神经元和神经纤维中［9］，其在这些位置的作用机理不清；②部分没有Otoferlin表达的哺乳动物模型也有胞吐作用［23］，为什么？③耳蜗不同部位、不同年龄导致Ca2＋依赖性胞吐敏感性改变，但Otoferlin蛋白的分泌没有明显变化［4］；④Otoferlin蛋白影响耳蜗听毛细胞传入突触囊泡胞吐释放，但是在前庭毛细胞是否有作用没有进一步研究［10，24］；缺乏Otoferlin蛋白的形态学和定量研究。因此，Otoferlin蛋白表达的影响还需要不断的深入研究；同时，Otoferlin蛋白除了作为Ca2＋“传感器”外，是否还存在其它的生理功能，都需要进一步的研究。

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