银翘散精简方、玉屏风散提取物在鸡胚中抗甲型流感病毒FM1株阻断与抑制作用研究

胡楠楠， 王雪峰， 王子， 岳志军， 南春红， 朱万青， 暴春晓

流感病毒（influenza virus）属于正黏病毒科成员，为单分子负链RNA病毒，能引起上下呼吸道疾病，中药在抗病毒方面有其独特的优势，特别是不易造成耐药性的优点，而在抗病毒研究和应用中备受关注。

自清初“温病学说”兴起，中医药对类流感样温病初期的治疗更上一个新的台阶，吴鞠通提出“治上焦如羽，非轻不举”创“银翘散”方沿用至今。在当今抗生素耐受、病毒变异等的现状下，中医药对于外感热病，在“扶正祛邪”总原则指导下彰显新的特点：一是在治疗用药上，从抗病原微生物作用的深入探讨“祛邪”治则，提出传统“肺毒热”理论［1］，循先证而治以“截断扭转”并且“清热解毒”贯穿始终；二是重视“扶正”，外邪入侵“首犯肺卫”，并且重视地域、节气的差别，“未病先防，已病防变”，在外感热病中适时应用清热解毒辛凉解表法和补肺实卫益气固表法之“双表法”相结合，清热解毒辛凉解表法代表方剂为银翘散，补肺实卫益气固表代表方剂为玉屏风散，临床起效颇佳［2］。

1 实验材料

1.1 药物

1.1.1 银翘散精简方提取物制备 银翘散精简方由金银花、连翘、牛蒡子、荆芥穗、薄荷（9∶9∶9∶5∶6）5味药组成，中药材均购于辽宁中医药大学附属医院。金银花、连翘、牛蒡子各9 g，荆芥穗5 g，薄荷6 g。采用70%乙醇为提取溶媒，8倍乙醇，经热回流提取2次，每次120 min。出膏率为14.44%。抽醇后，干燥粉末备用。

1.1.2 玉屏风散提取物制备 玉屏风散由黄芪、白术、防风（3∶3∶1）3味中药组成，黄芪、白术各30 g，防风10 g，中药材均购于辽宁中医药大学附属医院。采用70%乙醇为提取溶媒，10倍乙醇，经热回流提取2次，每次120 min。出膏率为25.16%。抽醇后，干燥粉末备用。

1.1.3 各中药提取物供试液配制 银翘散精简方提取物供试液配制：38／60×12.33×小鼠体质量（g）／1 000×出膏率（14.44%）；玉屏风散提取物供试液配制：70／60×12.33×小鼠体质量（g）／1 000×出膏率（25.16%）。将各组中药提取物用生理盐水配制成供试液，浓度为银翘散提取物78.3 g／L、玉屏风散提取物36.2 g／L，溶液进行药物2倍稀释。

1.1.4 阳性对照药物 利巴韦林注射液（福建古田药业有限公司，批号：0903251），生理盐水配制成200、100 g／L溶液备用。

1.2 病毒株、鸡胚 甲型流感病毒甲型流感病毒鼠肺适应株 A／FM1／47（H1N1），中国预防医学科学研究院病毒研究所提供。在无特定病原体鸡胚（9日龄，SPF级，购买于辽宁益康生物有限公司）中培养传代恢复毒力。

1.3 主要仪器与试剂 70%乙醇、生理盐水、利巴韦林注射液（福建古田药业有限公司，批号：0903251），生理盐水配制成100 g／L溶液备用等。生物安全柜（100%外排）（美国Baker公司，型号：SG403TXCE）；低温高速离心机（德国 Heraeus，型号：BIOFUGE28RS）；台式压力蒸汽灭菌器（沈阳盛达生物电子设备有限公司，型号：DYMⅡ－JB20L）；AR2140电子分析天平（上海奥豪斯公司，型号：AE200）；电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂，型号：HH.B11.420）；纯水机（法国 ELIX－S，型号：ZLXS5005Y）。

1.4 实验方法

与新教思想一样，儒家和陆九渊心学的世俗化主张并不是主张追求世俗享乐，而是主张在真实的日常世俗生活中追求成圣成贤，用更知名的话来说就是追求修身、齐家、治国、平天下。这种儒家的乃至陆九渊心学的世俗生活道德化的思想，与作为社会工作增能理论的思想基础的新教思想是有着相同之处的。

1.4.1 甲型（H1N1）流感病毒鼠肺适应株 A／FM1／47EID50的测定 将IV原液进行对数稀释9个浓度（10－9～10－1），接种于9日龄鸡胚，每个稀释度接种6枚鸡胚，每胚接种0.1 m L，另设3个鸡胚为生理盐水对照组，每个稀释浓度接种6个鸡胚，将鸡胚置于35℃恒温箱中孵育，经10 h间隔照蛋，弃去死亡鸡胚。连续观察3 d，并作观察记录。

1.4.2 中药提取物对鸡胚的最大无毒浓度的测定（TD0） 将3种提取物分别用灭菌生理盐水作连续2倍比稀释：21、原浓度、2－1、2－2、2－3，将这5个稀释度的稀释液分别接种于9日龄鸡胚尿囊腔，每个稀释度接种6胚，每胚接种0.2 m L，另设3枚鸡胚为空白对照组。将鸡胚置于35℃恒温箱中孵育，连续观察鸡胚生长发育情况。以鸡胚可存活96 h的最大浓度作为药物的最大无毒剂量。

1.4.3 中药提取物在鸡胚水平上对甲型流感病毒FM1株毒力阻断作用 先将最大无毒浓度的各组中药提取物供试液接种于9日龄鸡胚，将鸡胚置于35℃恒温箱中保温，4 h后取出，再将含有100×EID50的病毒液按每枚0.1 m L接种于鸡胚。每组中药提取物接种6枚鸡胚。另设利巴韦林组（100 g／L，6枚鸡胚）、病毒对照组（6枚鸡胚）、正常对照组（生理盐水）（3枚鸡胚）。将鸡胚置于35℃恒温箱中孵育，经10 h间隔照蛋，弃去死亡鸡胚。连续观察3 d，并作观察记录。

1.4.4 中药提取物在鸡胚水平上对甲型流感病毒毒力抑制作用 先将含有100×EID50的病毒液接种于9日龄鸡胚，将鸡胚置于35℃恒温箱中保温，4 h后取出，再将最大无毒浓度的各组中药提取物供试液接种于9日龄鸡胚。每组中药提取物接种6枚鸡胚。另设利巴韦林组（100 g／L，6枚鸡胚）、病毒对照组（6枚鸡胚）、正常对照组（生理盐水，3枚鸡胚）。将鸡胚置于35℃恒温箱中孵育，经10 h间隔照蛋，弃去死亡鸡胚。连续观察3 d，并作观察记录。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行分析，Fisher精确概率检验法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

流感病毒鸡胚半数感染量EID50为10－6。各组提取物接种尿囊液后，杂菌实验结果均为阴性。

2.1 各组提取物对鸡胚的最大无毒浓度的测定（TD0） 鸡胚尿囊腔接种药物后，每日观察鸡胚存活情况。银翘散、玉屏风散提取物各浓度组鸡胚生长发育与正常对照组基本一致；利巴韦林组鸡胚发育较小。观察72 h，银翘散精简方提取物自浓度39.15 g／L以下均存活，玉屏风散提取物自浓度36.2 g／L以下均存活，正常对照组与利巴韦林最高剂量组（200 g／L）、利巴韦林正常剂量组（100 g／L）鸡胚均存活，但利巴韦林最高剂量组鸡胚不能发育成鸡雏。

银翘散精简方提取物自39.15 g／L，玉屏风散提取物自36.2 g／L，未见鸡胚死亡，并发育良好。所以可以认为银翘散精简方提取物对鸡胚最大无毒浓度大于39.15 g／L，玉屏风散供试液对鸡胚最大无毒浓度大于为36.2 g／L，利巴韦林最大无毒剂量为100 g／L。因银翘散（39.15 g／L）、玉屏风散提取物（36.2 g／L）原液已达到最高浓缩浓度，故在计算TI时，以该最大无毒剂量代替半数中毒剂量，结果见表1。

表1 银翘散、玉屏风散提取物液及对鸡胚最大无毒浓度的测定

2.2 中药提取物在鸡胚水平上对甲型流感病毒毒力阻断作用 见表2。

表2 中药提取物在鸡胚水平上对甲型流感病毒FM1株毒力阻断作用的测定

结果表明，玉屏风散提取物 ED50：9.57 g／L，TI大于3.78，对甲型流感病毒FM1株的毒力阻断作用在浓度为36.2 g／L时，优于其他浓度；银翘散精简方提取物ED50：7.41 g／L，TI大于5.28，对甲型流感病毒FM1株的毒力阻断作用在浓度为19.58 g／L时，优于其他浓度；玉屏风散提取物对鸡胚死亡的阻断优于银翘散精简方提取物。

2.3 中药提取物在鸡胚水平上对甲型流感FM1株病毒毒力抑制作用 见表3。杂菌实验结果均为阴性。

表3 中药提取物在鸡胚水平上对甲型流感FM1株病毒毒力抑制作用的测定

表3结果表明，银翘散精简方提取物ED50为9.91 g／L，TI大于3.95，对甲型流感病毒 FM1株的毒力抑制作用在浓度为39.15 g／L时，优于其他浓度；玉屏风散提取物ED50为10.38 g／L，TI大于3.3，对甲型流感病毒FM1株的毒力抑制作用在浓度为36.2 g／L和18.1 g／L时（两者毒力抑制作用均等），优于浓度9.05 g／L；银翘散提取物对鸡胚死亡的阻断优于玉屏风提取物。

3 讨论

流感病毒为呼吸道常见病毒，其囊膜上的血凝素与神经氨酸酶抗原的变异频率很高，一种形式为抗原性漂移，另一种形式为甲型流感病毒所特有的抗原性转移，决定甲型流感病毒的治疗需要依据每年的病毒分离鉴别抗原性转移来进行疫苗的研制和药物的选择。当前FDA批准用于防治流感的药物只有金刚烷胺和金刚乙胺［3，4］，但由于他们仅对甲型流感病毒有效，并很快产生耐药株，而使其使用更加的严格导致应用受限。利巴韦林作为广谱抗病毒制剂，常用做抗呼吸道病毒研究的阳性对照，有文献报道，疾病早期使用利巴韦林雾化方法治疗流感儿童，可明显改善患儿的发热等症状［5］。从细胞水平测试利巴韦林对甲型H1N1流感病毒有明显抑制作用［6］，所以选择利巴韦林为阳性对照。

本课题组在前期研究中，对银翘散精简方和玉屏风散提取优化进行了大量的研究［7］，以“三水平四因素”为正交设计醇提，通过高效液相色谱法定量分析，设立优化评价权重，得出结论70%乙醇溶媒，8倍溶媒（银翘散精简方），10倍溶媒（玉屏风散），提取2次，每次120 min，本研究也沿用上述实验研究结果。

中医药对于外感热病有其独特的优势，中医认为外感热病的发生和发展是正邪交蒸的过程，“祛邪扶正”为其基本的治疗原则，根据中医“审证求因”原则，在疾病病情转变的过程中，原有症状的变化或新症状的出现，必定存在治疗方法的变化，外感热病初期使用辛凉解表药物并在疾病过程中重用清热解毒药物（以银翘散为代表方剂）［1］，当风热轻症向重症转化过程中，在治疗基础上适当扶正加用补肺实卫之品，防疾病转变本脏重症。对于某些患儿效果不理想，以及反复外感、病势缠绵，对其治疗配合使用补肺实卫益气固表，比如补肺实卫益气固表适时使用玉屏风散等药剂口服［8］，对已有的疾病防止其进一步发展和恶化，而在疾病好转或治愈后还要积极防止其复发及可能带来的后遗症。

本研究也证明了上述观点，在中药提取物对甲型流感病毒FM1株毒力阻断阶段，玉屏风散作用优于银翘散精简方，而在其毒力一直阶段，银翘散精简方更优。两种中药提取物在病毒毒力阻断、抑制作用和鸡胚死亡阻断的作用上更优于利巴韦林对照，其在动物实验阶段的研究尚在研究中。

［1］ 王雪峰.从肺毒热论治小儿肺炎本脏重症［J］.中医杂志，2012，53（3）：200－202.

［2］ 胡楠楠，王雪峰.从“双表法”论治小儿肺系外感热病［J］.中国中西医结合儿科学，2013，10（5）：413－414.

［3］ Cohen Stuart JW，Boucher CA，Cooper DA，et al.Summary of the III International Consensus Symposium on Combined Antiviral Therapy.［J］.Antiviral Res，1998，38 （2）：75－93.

［4］ Scholtissek C，Webster RG.Long－term stability of the anti－influenza A compounds－－amantadine and rimantadine［J］.Antiviral Res，1998，38（3）：213－215.

［5］ Rodriguez WJ，Hall CB，Welliver R，et al.Efficacy and safety of aerosolized ribavirin in young children hospitalized with influenza：a double－blind，multicenter，placebo－controlled trial［J］.J Pediatr，1994，125（1）：129－135.

［6］ 蒋虹，金光，丛喆，等.奥司他韦、利巴韦林和盐酸金刚乙胺对甲型H1N1流感病毒的抑制作用［J］.中国比较医学杂志，2011，21（2）：23－25.

［7］ 王文丽，王雪峰，郝欧美，等.银翘散提取工艺及指纹图谱初步研究［J］.辽宁中医药大学学报，2009，38（7）：174－176.

［8］ 任芳，李丽明.芪众颗粒预防流行性感冒的实验研究［J］.同济大学学报：医学版，2007，28（5）：40－42.