聚凝胺-微孔板法不规则抗体筛选方法的建立

任忠国

·实验研究·

聚凝胺-微孔板法不规则抗体筛选方法的建立

任忠国

目的建立聚凝胺-微孔板法筛查献血者不规则抗体的自动化检测方法。方法通过对红细胞浓度、聚凝胺试剂中各试剂量的加入比例、CUTOFF值的选择等，确定筛查方法的最佳参数与过程。结果确定的试验方法经实际工作检测，准确率高、灵敏度好，并实现了操作的自动化、标准化与批量化。结论聚凝胺-微孔板法适用于血站系统对献血者不规则抗体的大批量筛查。

聚凝胺-微孔板法；不规则抗体；批量化检测；结果判读标准化

对献血者进行不规则抗体的筛查，可以避免献血者血液中的不规则抗体输入患者体内引起的溶血性输血反应。目前在国内大多数血站并未采用全自动血型仪筛查献血者的不规则抗体，采用的方法多为盐水法、酶法、抗人球蛋白法及聚凝胺等试管法进行操作，难以进行大批量标本的检测。2011年起，我站采用聚凝胺-微孔板法进行献血者不规则抗体的筛查，实现了检测标本的批量化、标准化和自动化。现报告如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1血标本 全部为本站献血者的血液标本。

1.1.2仪器 AT PLUS2 全自动样本处理系统：瑞士HAMILTON公司；

HTIII扫描酶标仪：奥地利ANTHOS公司；

Thermostar 温育振荡器：奥地利ANTHOS公司；

UNIVERSAL 32 平板离心机：德国；

96孔硬质U型微孔板：浙江拱东。

1.1.3试剂 聚凝胺试剂：珠海贝索生物技术有限公司；O型筛选谱细胞、抗人球蛋白试剂、抗-D血清：上海血液生物医药责任公司。

1.1.4LISWELL实验室管理软件：烟台海深威公司。

1.2方法 96孔微孔板每孔加注献血者血清50ul→加入筛选谱细胞30ul→加入LISS液150ul →加入聚凝胺试剂30ul→设置AT加样仪暂停→离心(200 g)1 min→弃上清(直接弃或采用AT仪吸取)→放入振荡混旋15 s→观察全部凝集：试验有效→AT仪中继续加悬浮液50 ul→放入振荡混旋30 s→酶标仪(620nm)扫描判读结果。

2 结果

2.1实验条件的选择 ①O型筛选细胞:将购入的三支O型筛选谱细胞等体积混合，做为不规则抗体的筛选细胞。②阳性对照:IgG抗D血清(10倍稀释)。③温育振荡条件的选择:根据不规则抗体血清反应的最适温度，设定反应温度为37℃，选择加入悬浮液后的振荡时间、振幅、振荡频率为30 s、振幅为1、频率为800RPM。④离心条件的选择:根据聚凝胺试剂说明书确定离心条件为200 g，1 min。⑤扫描点数及Cutoff值的确定:根据微孔凝集反应的特点：凝集红细胞沉集于孔底，形成钮扣状；未凝集红细胞混旋后，均匀散布于孔底。所以凝集孔由孔中心向外透光率逐渐增大；而未凝集孔，整孔透光率较一致，无大的变化。根据这一特点，我们确定扫描点为除孔中心19点外的16点为扫描点(酶标仪为35点扫描)。

Cutoff值的确定：采用冯健亮[1]等研究的微板法Cutoff值符合正态分布的结论，利用数理统计方法计算得出的自动微板法Cutoff值，确定本法Cutoff值为0.36～0.50。<0.36为阴性，>0.50为阳性，介于两者之间的为可疑标本，采用试管法以抗人球蛋白的方法确认。

2.2应用效果 自2011年3月份以来，我们共进行了近2万人份的不规则抗体筛查工作。筛查出6例不规则抗体阳性标本，经进一步确认，全部为阳性，一次判读阳性准确率达100%。

3 讨论

不规则抗体的筛查方法有多种，如盐水法、酶法、抗人球法、聚凝胺法以及微柱凝胶等方法[2]，这些方法各有优缺点，如盐水法仅能检测IgM类抗体，其他几种方法虽能检测出各类不规则抗体，但由于采用试管法，操作时间较长，难以批量化、自动化检测，因此多用于抗体的鉴定。采用微孔板法进行不规则抗体筛查，也有过报导。如采用抗人球-微孔板法进行的筛查方法[3]，存在着检测时间长，中间过程红细胞需洗涤等。还有报导采用聚凝胺-微孔板法检测不规则抗体，但中间过程不弃上清，直接在加入聚凝胺的LISS液中加入悬浮液，然后通过混旋振荡来观察结果。这种方法会因为减少一步操作而节约了检测时间，但不可避免的会由于LISS液、聚凝胺与悬浮液之间产生的中和反应，而使检测结果的灵敏度及特异性均会有不同程度的下降。而采用本检测方法则可有效避免这一过程，既可使检测时间缩短，操作过程简便，又可保证检测结果的准确性。

我们利用全自动酶标加样系统建立的全自动不规则抗体筛查方法在进行了大量数据优化的基础上，经近2万份样本的实际检测，一次判读的阳性准确性达100%。具有操作简便，使用试剂量较少，结果判读准确率较高，易于推广与批量化等优点。同时在检测方法学上，有研究表明聚凝胺-微孔板法对弱阳性IgG抗D抗体检测的灵敏度高于试管法[4]，因此适合血站系统对大批量样本的不规则抗体的快速筛查。

[1] 冯健亮,等. ABO血型自动微板法Cutoff值建立研究.现代检验医学杂志，2003，18(4)：31-32.

[2] 高峰.输血与输血技术.人民卫生出版社，2003：90-95.

[3] 韩惠云,张国平,李雪英,等.自动微板法筛查献血者不规则抗体的参数优选.中国现代药物应用,2011，4(5)：149-150.

[4] 李鑫，葛红卫，涂东晋,等.聚凝氨-微板法筛查不规则抗体的实验研究.福建医药杂志，2007，29(5)：107-109.

117000 辽宁省本溪市中心血站