手工制作组织芯片及体会

李学礼 潘云

组织芯片（tissue chip），也称组织微阵列（tissue microarrays），是生物芯片技术的一个重要分支，是将许多不同个体组织标本以规则阵列方式排布于同一载玻片上，进行同一指标的原位组织学研究。该技术自1998年[1]问世以来，因其具有高信息量、高效、节省检测试剂、减少实验误差、增加可比性、易于标准化等优点，且其制备技术简单[2]，容易掌控，得到大范围的推广应用。

为此本文参照部分文献自行手工方法制作组织芯片，取得了比较满意的效果，现制作过程和经验体会简短介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料 套管打孔针，采用北京博康实验仪器有限公司生产的组织芯片制备仪所佩带直径2 mm套针。

1.1.1 石蜡采用国产的熔点为58～60℃医用石蜡

1.1.2 主要的实验仪器及设备 自制石蜡包埋用铅模；恒温恒湿箱（上海博讯是也有限公司医疗设备厂）；莱卡全自动石蜡切片机（德国）；莱卡DM3000多头显微镜（德国莱卡公司）。

1.1.3 实验用病理标本为大理学院附属医院病理科2012 年

1 -5 月乳腺癌手术切除的病理乳腺癌标本

1.2 方法

1.2.1 制作前石蜡 石蜡在65～67 ℃条件下熔化并放65恒温恒湿箱中保持熔化状态下备用。

1.2.2 供体标本的准备及筛片 实验用供体蜡块为病理科常规蜡块标本，调取其对应HE 染色玻片，经有经验的病理科医师显微镜阅片后选取病变典型部位并在供体蜡块上作好相应标记备用

1.2.3 组织芯片制作方法 用自制铅模为蜡块模具制作厚约8 mm，大小2 cm×2.5 cm的受体蜡块，并将其置于40 ℃恒温台上用打孔套针打孔，在受体蜡块上构建3×4个点阵，孔间距为3 mm。用打孔套针在供体蜡块所做标记处抽取组织芯条，放入受体蜡模孔内。并用套针（带套芯）压实组织芯条。将受体蜡模（已塞入芯条）连同铅模放入60℃恒温恒湿烤箱中40 min，使组织芯条与芯孔周边蜡体紧密融合，将受体蜡块（带铅模）进行二次包埋，包埋后立刻放入60 ℃恒温恒湿烤箱中20 min，进行再次充分融合，取出受体蜡块冷却，即可制成组织芯片蜡块备用。

1.2.4 切片 冰组织芯片蜡块好后以4 μm厚连续切片，裱贴于准备好的载玻片上。微阵列蜡块的切片由经验丰富的病理科医师在德国徕卡切片机上进行切片；其过程与常规组织切片相同，但因为蜡块内的组织芯条较多，裱片时操作要轻、稳，速度适宜，避免组织切片的离断或芯片内芯点阵列的偏移。共制作蜡块4个，各切片2 张共8张切片。放在70 ℃烤片机上烘烤20 min，完成组织芯片的制作。

2 结果

制作3×4组织芯片共8张，HE染色后芯片无脱片、倒浮现象，各芯点完整，仅伴有轻度点阵移位现象。

3 讨论

组织芯片技术是生物芯片技术的一个重要分支，首先是Battifora[3]在1986 年提出来的，直到1998年，由Kononen 等[1]提出了组织芯片的明确概念，于是一种新的大样本，高通量的快速分析工具在医学分子生物学领域得到迅速的发展，该技术有诸多优点，如高信息量、高效、节省检测试剂、减少实验误差、增加可比性、易于标准化，且其制备技术简单，易掌控。组织芯片结合传统病理学技术、免疫组织化学（IHC），原位杂交（ISH）及荧光原位杂交（FISH）等分子生物学技术[4-5]，可以广泛地运用于生命科学研究等诸多领域。

3.1 供体蜡块的筛选 选取病理科供体蜡块及相对的切片，首先由经验丰富的病理科医生进行切片的筛片，准确的找出病变明显的区域并相应的作出标记，注意标记的直径小于3 mm，从而尽量避免因标记区域过大而出现无效组织。因部分蜡块经反复使用，内部组织厚薄不已，所取组织芯条易出现长短不一或不含所需组织，所以尽量选取组织块较厚的蜡块，以提高制备的组织芯片的利用率。

3.2 受体蜡块的制备 打孔时，若空白受体蜡块温度过高，不易成形，温度过低，易将蜡模打裂，产生废模[6-7]，经多次实验，将制好的空白蜡块置于50℃的恒温箱中20 min，取出置于40～50 ℃操作台上迅速打孔，打孔时，避免用力挤压蜡模致芯孔受压缩小。

3.3 组织芯条的钻取 钻取组织芯条的过程中，首先将供体蜡块置于45 ℃的恒温箱中10 min，取出置于40～50 ℃操作台上迅速钻取组织芯条，钻取中应垂直进针，均匀用力，防止损伤供体蜡块。

3.4 组织芯片蜡块的二次包埋 将组织芯条按顺序置入受体蜡块后，并用套针（带套芯）压实组织芯条，使芯条在同一平面上，然后进行受体蜡块的二次包埋，包埋采用熔化石蜡普通灌注的方法[8]，具体过程是，首先将供体蜡块（已塞入芯条）连同铅摸一起置于60 ℃烤箱内1 h，然后取出注入熔化石蜡，再将蜡模同蜡块置于60 ℃烤箱内30 min，再次进行重新熔合，石蜡组织芯与空心蜡模孔壁间存在微小间隙，熔化的石蜡接触蜡模时，未充分填充微小间隙便开始凝固，从而使二次包埋失败。先将其置入60 ℃烤箱内1 h，主要目的是使两者重新熔为一体，从而达到目的[8-10]。二次包埋成功的组织芯片蜡块，应具备以下特点：（1）组织芯片蜡块中的组织芯条排列整齐，无倒浮、移位现象；（2）蜡块中组织芯条所含的目标组织处于同一平面上，便于统一切片；（3）石蜡组织芯条与空心蜡模间空隙填充良好，并充分熔合，所制备组织芯片中的微组织块无脱片、皱褶现象。

3.5 组织芯片的切片 为保证蜡块微组织的完整性，每块组织芯片蜡块需多切片；漂片时水温要适宜，若温度过高组织片所含的微组织易发生离散，温度过低则难以保证其充分展开。

3.6 组织芯片技术的应用 组织芯片的应用领域正在不断的拓展，可用于免疫组织化学（IHC），原位杂交（ISH）及荧光原位杂交（FISH）等原位组织检测技术。

3.7 组织芯片的敏感性和准确性 Garcia 等[11]研究证实组织芯片技术与传统制片方法具有相同的敏感性和准确性， 组织芯片技术可以替代传统制片技术。但是，有些学者发现组织芯片技术仍存在一定的偏倚[12]。为反映原组织结构的信息，本实验所采取的组织样本是直径2 mm。

3.8 组织芯片的缺点 织芯片也存在其不足的以下几个方面，如组织取材相对较少，所取位点的微组织并不一定能完全反应肿瘤的全貌，切片微组织易移位、脱落，从而给结果的判定带来误差。

组织芯片技术具有高信息量、高效、低消耗、自身内对照和易于标准化等诸多优点，且其制备技术简便、易行、经济实用。 组织芯片技术还可以与免疫组织化学、核酸原位杂交、荧光原位杂交、原位PCR等诸多常规技术相结合应用，它的应用领域正在不断地拓展。

[1]Kononen J，Bubendorf L，Kallioniemi A，et al. Tissue microarrays for high -throughput molecular profiling of tumor specimens[J].Nature Med，1998，4（7）：844-847.

[2]朱明华.组织微阵列及其在肿瘤病理研究中的应用[J].中华病理学杂志，2002，31（1）：72-73.

[3]Battifora H. The multitumor （sausage）tissue block： Novel method for immunohistochemical antibody testing[J]. Lab Invest，1986，55（2）：244-248.

[4]Andersen CL，Monni O，Wagner U，et al. Highthrough-put copy number analysis of 17q23 in 3520 tissue specimens by fluorescence in situ hybridization to tissue microarrays[J].Am J Pathol，2002，16173-16179.

[5]Fedor HL，De Marzo AM. Practical methods for tissue microarray construction[J]. Methods Mol Med，2005，103（56）： 89-101.

[6]倪灿荣，李芳梅，朱明华，等. 提高组织芯片切片成功率的方法和体会[J]. 中华病理学杂志，2002，31（6）：559-560.

[7]孟奎，石群立，马恒辉，等. 组织芯片制备新方法[J]. 医学研究生学报，2005，18（3）：287-289.

[8]王文勇，李玉松，黄高昇，等. 石蜡组织芯片制备技术方法的改良[J]. 第四军医大学学报，2005，26（1）：93-94.

[9]倪灿荣，李芳梅，朱明华，等. 提高组织芯片切片成功率的方法和体会[J]. 中华病理学杂志，2002，31（6）：559-560.

[10]樊祥山，孟凡青，章宜芬，等. 骨肉瘤组织芯片的制作及其免疫组织化学应用[J]. 东南大学学报（医学版），2006，25 （2）：104-107.

[11]William S S，Alosoo T R，Mayhew E，et al . Arrest of human lung tumor xenograft growth in severe combind immunodeficiency mice using Doxorubiom encapsulated insterically stabilized liposomes[J]. Cancer Res，1993，53（10）： 3964-3967.

[12]Renkvist N，Castelli C，Robbins P F，et al. A listing of human tumor antigens recognized by T cells [J]. Cancer Immunol Immunother，2001，50（21）：3-15.