乙醛脱氢酶2在法舒地尔心肌保护作用中的机制

叶红伟 康品方 王洪巨 李正红 关宿东 高 琴 (蚌埠医学院生理学教研室，安徽 蚌埠 33030)

乙醛脱氢酶2在法舒地尔心肌保护作用中的机制

叶红伟1康品方2王洪巨2李正红 关宿东 高 琴1(蚌埠医学院生理学教研室，安徽 蚌埠 233030)

目的探讨乙醛脱氢酶2(ALDH2)是否参与Rho激酶抑制剂法舒地尔的心肌保护作用，并分析其可能机制。方法采用离体大鼠心脏，结扎冠状动脉左前降支30 min模拟局部心肌缺血，松开结扎线恢复灌流120 min复制心肌缺血/再灌注(I/R)模型。实验分4组:I/R组、法舒地尔组、ALDH2抑制剂氨基氰(CYA)组和法舒地尔+CYA(联合组)组。连续记录左心室动力学变化，再灌注期间收集冠脉流出液测定乳酸脱氢酶(LDH)含量;RT-PCR检测ALDH2 mRNA表达以及Bcl-2/Bax比值的变化。结果与I/R组比，法舒地尔组明显促进了左室发展压、左心室内压最大上升和下降速率、左心室做功的恢复，降低复灌期冠脉流出液中LDH的释放，ALDH2 mRNA表达增加，Bcl-2/Bax比值增高。ALDH2抑制剂CYA明显减弱法舒地尔的作用，抑制了心室动力学指标的恢复，LDH释放增多，ALDH2 mRNA表达降低，Bcl-2/Bax比值降低。结论法舒地尔抑制Rho激酶信号通路发挥心肌保护作用，其机制可能与激动ALDH2、抑制凋亡发生有关。

心脏;缺血/再灌注损伤;乙醛脱氢酶2;Rho激酶;法舒地尔;氨基氰

Rho/Rho激酶信号通路参与高血压、心力衰竭、心肌梗死和动脉粥样硬化(AS)等主要心血管疾病的发生。多数研究显示抑制Rho激酶可以通过激活PI3K/Akt/eNOS途径来保护心血管系统，提示心脏I/R损伤中的Rho激酶可能抑制RISK途径〔1～3〕。乙醛脱氢酶2(ALDH2)是存在于线粒体内的一种氧化乙醛的酶，已有研究表明ALDH2激动剂可以保护心肌，对抗I/R损伤〔4〕。抑制Rho激酶活性和激活ALDH2都可以发挥心肌保护作用，但两者是否存在关系，目前尚不清楚。本研究观察Rho激酶抑制剂法舒地尔和ALDH2抑制剂氨基氰(CYA)对心脏功能的影响，探讨ALDH2是否参与法舒地尔的心肌保护作用，为临床I/R损伤的治疗提供新的线索。

1 材料与方法

1.1 实验动物和材料 健康雄性SD大鼠体重200～250 g，清洁级，32只，由蚌埠医学院实验动物中心提供。川威注射液(盐酸法舒地尔注射液)购自天津红日药业股份有限公司;CYA购自 Sigma公司。改良 Krebs-Henseleit(K-H)液成分:NaCl 118 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，葡萄糖11 mmol/L，pH 7.3～7.4。Trizol试剂购自Invitrogen公司;反转录试剂盒和PCR试剂盒购自Fermentas公司;引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，所用ALDH2引物:上游5'-GTG TTCGGA GACGTCAAA GA-3'，下游 5'-GCA GAG CTT GGG ACA GGT AA-3'，预计扩增产物长187 bp;Bax引物:上游5'-GGA TCGAGCAGAGAGGATGG-3'，下游5'-TGG TGA GTG AGG CAG TGA GG-3'，预计扩增产物长464 bp;Bcl-2引物:上游5'-AG CCT GAG AGC AAC CGA AC-3'，下游 5'-CGG TAG CGA CGA GAG AAG-3'，预计扩增产物长163 bp;以β-actin为内参照，引物上游5'-GAT GGT GGG TAT GGG TCA GAA GGA C-3'，下游 5'-GCTCAT TGC CGA TAG TGA TGA CT-3'，预计扩增产物长630 bp。

1.2 大鼠心肌I/R损伤模型复制及分组 大鼠置于断头器上断头，开胸后迅速取出心脏并置冰水停搏，悬主动脉于Langendorff装置上行逆行灌流。K-H液常规恒压(76 mmHg)灌流，以95%O2+5%CO2饱和，维持灌流液温度37℃。将充水乳胶囊由切开的左心耳处插入至左心室，囊内压力经特氟纶管传递至压力传感器，由Medlab生物信号采集处理系统记录和分析。各组心脏均稳定20 min后，进行实验处理。大鼠随机分为4组，每组8只:①I/R损伤组:结扎大鼠冠状动脉左前降支30 min模拟局部心肌缺血，随后松开结扎线恢复灌流120 min作为单纯I/R;②法舒地尔组:同I/R组，但在缺血前10 min至再灌注初期10 min给予Rho激酶抑制剂法舒地尔30μmol/L，共灌流50 min;③CYA组:同I/R组，但在缺血前10 min至再灌注初期10 min给予 ALDH2抑制剂 CYA 1 mmol/L，共灌流50 min;④法舒地尔+CYA组(联合组)。

1.3 左心室功能评价 向插入左心室内的乳胶囊注水使左心室舒张末压(LVEDP)维持于4～8 mmHg，连续记录左心室发展压(LVDP)、左心室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)和LVEDP等各项指标，并计算左心室做功量(RPP)的变化，RPP=LVDP×HR。

1.4 大鼠灌流心脏冠脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)测定 分别在复灌第5和第10分钟收集冠脉流出液，利用分光光度法测定LDH的含量，单位以U/L表示。

1.5 RT-PCR检测ALDH2、Bax和Bcl-2 mRNA表达 采用Trizol一步法提取左心室心尖部组织总RNA，取总RNA3μl为模板，用随机引物反转录合成cDNA，以此cDNA 1.5μl为模板，进行PCR扩增。扩增条件:95℃预变性3 min后，以①95℃50 s变性;②ALDH2退火温度 59.8℃ 45 s，Bax退火温度62.2℃ 45 s，Bcl-2退火温度57.6℃ 45 s，β-actin退火温度55.5℃45 s;③72℃60 s，反应30个循环，最后一轮延伸10 min。将4μl PCR扩增产物于15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶显色。GIS凝胶图像处理系统中拍摄记录，使用图像分析软件对泳带进行光密度扫描作半定量分析，以目的基因与内参对照的积分吸光度比值(ALDH2/β-actin;Bcl-2/β-actin;Bax/βactin)表示mRNA相对表达量。

1.6 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件，数据以±s表示，各组间数据显著性检验采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 左心室功能改变 单纯I/R组缺血与复灌期间LVEDP上抬，LVDP降低，±dp/dtmax降低，RPP减少;与单纯I/R组相比，法舒地尔组降低了LVEDP，明显促进了LVDP、±dp/dtmax的恢复，增加了RPP;与法舒地尔组相比，ALDH2抑制剂CYA减弱了法舒地尔的作用，使LVDP降低、±dp/dtmax降低、RPP减少。见表1。

2.2 冠脉流出液中LDH含量测定 与单纯I/R相比，法舒地尔组冠脉流出液中LDH释放减少，CYA组LDH释放增加;与法舒地尔组相比，联合组LDH释放增加。见表2。

2.3 心肌组织ALDH2、Bcl-2和BaxmRNA的表达 与单纯I/R组相比，法舒地尔组ALDH2mRNA表达增加，Bcl-2/Bax比值增高;与法舒地尔组比较，联合组ALDH2 mRNA表达显著减少，Bcl-2/Bax比值降低。见表3，图1和图2。梗死后心衰小鼠心肌细胞的凋亡的发生，抑制p53的表达〔9〕。越来越多的证据支持ALDH2可能是行之有效的心肌保护因子，成为目前心血管疾病发病机制研究新的热点。本实验结果提示CYA抑制ALDH2表达后减弱了法舒地尔的心肌保护作用，ALDH2可能是Rho激酶的下游信号途径。

表1 离体大鼠心脏血流动力学参数(n=8，±s)

表1 离体大鼠心脏血流动力学参数(n=8，±s)

与I/R组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与法舒地尔组比较:3)P＜0.05，4)P＜0.01

120 min LVDP(mmHg) I/R组 62.69±6.76 46.44±5.20 27.49±5.63 21.40±4.67参数 缺血前 缺血30 min 复灌60 min 复灌法舒地尔组 69.50±4.83 45.79±7.33 37.90±7.462) 32.89±7.092)CYA组 64.11±10.42 29.93±11.85 23.90±0.244) 18.29±1.264)联合组 62.05±14.74 41.47±13.86 28.66±8.904) 21.55±7.434)LVEDP(mmHg) I/R组 5.35±0.41 13.19±5.05 33.54±7.49 26.81±9.43法舒地尔组 5.92±0.57 12.59±2.58 19.84±2.552) 15.96±2.591)CYA组 6.34±0.33 34.19±9.59 43.95±9.762)4) 41.09±11.612)4)联合组 6.45±0.63 15.35±5.37 23.33±5.452) 17.46±4.711)+dp/dtmax(mmHg/s)(×103) I/R组 1.79±0.26 1.36±0.14 0.88±0.05 0.73±0.07法舒地尔组 2.03±0.19 1.39±0.19 1.19±0.192) 1.04±0.172)CYA组 1.79±0.53 0.90±0.33 0.76±0.064) 0.64±0.044)联合组 1.75±0.57 1.12±0.34 0.87±0.234) 0.68±0.194)-dp/dtmax(mmHg/s)(×103) I/R组 1.28±0.14 0.94±0.06 0.60±0.03 0.51±0.02法舒地尔组 1.39±0.09 0.91±0.08 0.69±0.052) 0.60±0.052)CYA组 1.21.±0.19 0.57±0.17 0.50±0.012)4) 0.43±0.0021)4)联合组 1.22±0.28 0.75±0.18 0.55±0.102) 0.46±0.081)4)RPP(mmHg/s)(×103) I/R组 20.14±0.83 13.46±2.32 6.64±0.07 4.75±0.25法舒地尔组 20.62±1.62 12.16±2.67 8.93±1.302) 5.70±0.432)CYA组 18.97±1.19 8.17±3.28 6.41±0.174) 4.74±0.083)联合组 19.56±2.23 10.73±1.70 5.95±1.464) 3.93±1.111)4)

表3 各组心肌组织中ALDH 2 m RNA表达、Bcl-2/Bax比值变化(n=8，±s)

表3 各组心肌组织中ALDH 2 m RNA表达、Bcl-2/Bax比值变化(n=8，±s)

与正常组比较:1)P＜0.01;与I/R组比较:2)P＜0.05;与法舒地尔组比较:3)P＜0.05，4)P＜0.01

组别 ALDH2/β-actin Bcl-2/Bax I/R组 0.38±0.031) 0.31±0.051)法舒地尔组 0.45±0.072) 0.36±0.011)2)CYA组 0.37±0.041)4) 0.26±0.031)2)4)联合组 0.34±0.031)4) 0.32±0.011)3)

图1 ALDH2 m RNA琼脂糖凝胶电泳图

Rho激酶信号途径、ALDH2均与细胞凋亡密切联系。体外实验证明，腺病毒过度表达激活的RhoA作用于Rho激酶可导致心肌细胞肥大，通过上调Bax表达诱导线粒体途径的心肌细胞凋亡〔10〕。本实验室前期工作〔11〕观察到激动ALDH2可上调心肌Bcl-2 mRNA，降低 Bax mRNA，Bcl-2/Bax比值增加;阻断ALDH2后，Bcl-2 mRNA水平下调，BaxmRNA水平升高，加重心肌细胞凋亡。本实验结果提示抑制Rho激酶上调ALDH2 mRNA表达的同时亦抑制细胞凋亡的发生。综上，法舒地尔抑制Rho激酶信号通路发挥心肌保护和抗凋亡作用可能与激动ALDH2有关，其具体机制还有待进一步探讨。

图2 Bcl-2 mRNA和Bax m RNA琼脂糖凝胶电泳图

3 讨论

I/R损伤发生机制非常复杂，目前尚未完全阐明。氧化应激、钙超载、血管内皮细胞、中性粒细胞学说等已经得到公认，研究报道，Rho激酶参与了心脏I/R损伤，抑制Rho激酶可阻止Bcl-2的下调、降低炎症反应、减少心肌梗死面积、降低心肌细胞凋亡〔1，5，6〕。Rho激酶抑制剂法舒地尔可以发挥抗心肌 I/R 损伤作用。本实验结果提示法舒地尔抑制Rho激酶发挥了抗心肌I/R损伤作用，且可能与激动ALDH2有关。ALDH2是线粒体内一种重要的醛类氧化酶。研究发现ALDH2在心血管疾病的发生、发展过程中发挥重要作用，参与了心力衰竭、AS、冠心病、高血压等疾病的发生。ALDH2缺失与机体内疾病的发生是否相关引起关注，Takagi等〔7〕发现ALDH2基因缺失是日本男性人群中心肌梗死发生的危险因素。通过转基因技术使小鼠ALDH2表达增加可对抗慢性乙醇中毒引起的心力衰竭的发生、心功能的降低及内质网应激而发挥保护作用〔8〕。转染ALDH2腺病毒载体使ALDH2基因高表达，可以有效地抑制急性心肌

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M echanism exploration of aldehyde dehydrogenase 2 in the cardioprotection of fasudil

YE Hong-W ei，KANG Pin-Fang，WANG Hong-Ju，et al.
Departm ent of Physiology，the First Affiliated Hospital of Bengbu M edical College，Bengbu 233004，Anhui，China

ObjectiveTo investigate whether aldehyde dehydrogenase 2(ALDH2)was involved in the cardioprotection of fasudil，the inhibitor of Rho-kinase，and explore themechanism.MethodsHearts isolated from male SD rats were subjected to 30 minutes of regional ischemia(occlusion of left anterior descending artery)followed by 120 minutes of reperfusion.The experiment was divided into 4 groups:I/R，Fasudil，ALDH2 inhibitor CYA and Fasudil+CYA groups.The left ventricular hemodynamics were continuous recorded，the coronary effluentwas collected during the reperfusion period to determinate lactate dehydrogenase(LDH)levels.ALDH2 mRNA expression and the ratio of Bcl-2/Bax were detected by RT-PCR.ResultsCompared with I/R group，fasudil significantly increased the restore of left ventricular developed pressure，maximal rise/fall rate of left ventricular pressure and rate pressure product，reduced LDH release during reperfusion period，ALDH2mRNA expression and the ratio of Bcl-2/Bax were increased.CYA，the ALDH2 inhibitor reduced the role of fasudil，which inhibited the recovery of ventricular hemodynamical parameters，increased LDH release，it also inhibited the expression of ALDH2 mRNA，and Bcl-2/Bax ratio was decreased.ConclusionsFasudil can play myocardial protection by inhibiting Rho-kinase signaling pathway，and maybe related with excitement of ALDH2 and inhibiting apoptosis happening.

Heart;Ischemia/reperfusion injury;Aldehyde dehydrogenase 2;Rho-kinase;Fasudil;Cyanamide

R363.2

A

1005-9202(2013)05-1070-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.05.039

国家自然科学基金资助项目(No.81000074);安徽省自然科学基金资助项目(No.090413097)

1 安徽省组织移植重点实验室

2 蚌埠医学院第一附属医院心血管内科

高 琴 (1977-)，女，博士，副教授，主要从事心血管生理学研究。

叶红伟(1984-)，男，硕士，主要从事心血管生理学研究。

〔2012-02-16收稿 2012-04-12修回〕

(编辑 曹梦园)