喉鳞癌患者术后组织中神经纤毛蛋白1、2的表达及对血管生成的作用

焦胜敏 (廊坊卫生职业学院，河北 廊坊 065001)

喉鳞癌患者术后组织中神经纤毛蛋白1、2的表达及对血管生成的作用

焦胜敏 (廊坊卫生职业学院，河北 廊坊 065001)

目的观察喉鳞癌组织中神经纤毛蛋白(NRP)1、2的表达特点，关注二者对肿瘤中CD34阳性的血管生成的作用。方法收集79例喉鳞癌标本作为观察组，收集53例正常喉黏膜组织作为对照组，应用免疫组织化学技术检测二组中NRP1、NRP2和CD34的表达，分析其在不同临床特征中的表达差别及相关性。结果喉鳞癌中NRP1、NRP2表达的阳性率和CD34标记的微血管密度(MVD)明显高于对照组，观察组中NRP1、NRP2表达的阳性率和MVD与肿瘤体积、淋巴结转移、淋巴结转移数量及Ki67的表达密切相关，线性相关分析显示NRP1和MVD、NRP2和MVD具有正相关性，生存分析显示NRP1、NRP2和MVD与患者的预后相关。结论NRP1、NRP2和MVD高表达在喉鳞癌的发生发展中具有重要作用，NRP1、NRP2具有促进CD34阳性的血管生成的作用，联合检测NRP1、NRP2和MVD可能与喉鳞癌的预后密切相关。

喉鳞癌;神经纤毛蛋白(NRP)1;NRP2;CD34;免疫组织化学

喉鳞癌发生与发展是多因素综合作用的结果。肿瘤进展过程由多种基因和蛋白调控。神经纤毛蛋白(NRP)家族是Semaphorins成员的受体，其具有两个重要成员，即 NRP1、NRP2，二者在恶性肿瘤中高表达，近年来研究显示 NRP1和NRP2可能对肿瘤中的血管生成有重要的促进作用〔1〕。CD34是血管新生的重要标志物，对血管内皮的标记作用强〔2〕。本实验探讨喉鳞癌组织中NRP1和NRP2的表达特征，关注二者对CD34阳性的血管密度(MVD)的作用，探讨其表达的临床价值及对判断预后的价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料 廊坊市人民医院2005年1月至2006年7月存档的喉鳞癌标本的蜡块79例作为观察组，均符合WHO中关于喉鳞癌的诊断标准，并经病理科专家确诊。年龄54～79(平均59.2)岁，肿瘤大小0.5～5.3 cm。同时选取同期病理证实为正常喉黏膜组织53例作为对照组。二组在一般临床资料的比较中无明显差别，具有可比性。

1.2 方法 NRP1、NRP2和CD34的浓缩液均购自武汉博士德生物技术有限公司，实验前均进行预实验，选择最理想稀释浓度用于正式实验。免疫组化应用SP法完成，严格质量控制。具体步骤:脱蜡后置于自来水中进行水化，3%H2O2去离子水孵育10 min后，行抗原修复，加入稀释好的 NRP1、NRP2或CD34一抗蛋白，在室温中孵育2 h，应用 PBS进行冲洗，5 min×3次;加入二抗，在室温中孵育20 min，应用PBS进行冲洗，5 min×3次;加入辣根酶标记链霉卵白素，在室温中孵育半小时，应用PBS进行冲洗，5 min×3次;加入DAB进行显色后自来水冲洗，按常规操作进行封片。

1.3 结果判定标准 NRP1、NRP2蛋白的阳性细胞均位于细胞质中，以染成棕黄或棕褐色为阳性，随机观察计数10个高倍视野的NRP1、NRP2蛋白的阳性表达细胞数的百分率，取其平均值，以平均每个高倍镜视野的阳性肿瘤细胞数≥25%为阳性，以 ＜25%为阴性，计算阳性率。MVD的判断方法:确定CD34染色细胞丛作为一个血管，先在低倍镜下全面观察切片以确定肿瘤内血管密度最高处。再在高倍镜下，以与周围肿瘤细胞和结缔组织成分明显区别的任何一个棕色染色的内皮细胞或细胞丛为一个血管，只要结构不相连，其分支结构也作为一个血管计数。记录5个视野内的微血管数，取其平均数。

1.4 统计学方法 应用SAS6.12统计软件，采用χ2检验或t检验，并进行线性相关性分析和生存分析。

2 结果

2.1 NRP1、NRP2和MVD在观察组与对照组中的表达 由表1可见，观察组与对照组中NRP1、NRP2表达的阳性率和CD34标记的微血管密度差别显著(P＜0.01)。

2.2 NRP1、NRP2和MVD在观察组中不同临床特征中的表达比较 观察组中NRP1、NRP2和MVD与肿瘤直径、淋巴结转 移、淋巴结转移数量及Ki67的表达密切相关。见表2。

表1 NRP1、NRP2阳性表达和MVD在观察组与对照组中的表达

2.3 喉鳞癌组织中NRP1、NRP2和MVD表达的关系 对观察组中NRP1、NRP2和MVD的表达进行线性相关性分析，结果显示 NRP1和 NRP2(r=0.45，P=0.022 1)、NRP1 和 MVD(r=0.43，P=0.014 2)、NRP2 和 MVD(r=0.43，P=0.035 9)均呈正相关性。

2.4 喉鳞癌组织中NRP1、NRP2和MVD的表达与生存的关系随访时间7～60(平均37.5)个月。经生存分析显示，NRP1(χ2=6.15，P=0.022 4)、NRP2(χ2=8.35，P=0.017 6)和 MVD(χ2=10.09，P=0.010 9)的表达与预后相关，即 NRP1、NRP2 和MVD高表达患者的预后差。

3 讨论

NRP1和NRP2常表达在内皮细胞及一些肿瘤细胞，是神经生长因子抑制因子Sema 3A和血管内皮生长因子165的受体，因此NRP1和NRP2对神经轴突的生长及血管的生成有重要促进作用。NRP1和NRP2是潜在血管生成因子，其在肿瘤细胞恶变及血管化中高表达，尤其是当NRP1和NRP2高表达时常伴随着血管内皮生长因子的高表达。有研究通过体内诱导AT2.1细胞表达NRP1时，可以引起肿瘤体积的增加，肿瘤部位新生毛细血管密度增加〔3〕，内皮细胞增殖，血管扩张，此时肿瘤的凋亡指数下降〔4〕。因此NRP1和NRP2可能类似癌基因的作用，也可能通过VEGF的过表达引起肿瘤的血管增生，使肿瘤增大，加速肿瘤的进展。血管生成是当今人们关注的重要生物学行为，其调节蛋白关系复杂，通路作用多〔5〕。CD34是现今被人们认为标记血管生成的最好标记物，在血管新生方面明显优于Ⅷ因子等血管标记物〔6〕。肿瘤分泌多种成血管信号时，肿瘤血管可以由周围正常组织的固有血管向肿瘤组织内容延伸而成，也可以通过内皮细胞前体细胞分化后形成内皮依赖性血管。NRP1、NRP2与肿瘤的血管生成可能具有内在关系，并已引起学者们的关注。

本研究结果提示NRP1、NRP2和血管密度在肿瘤进展中具有重要作用;且NRP1、NRP2可能参与肿瘤的进展及淋巴道转移。由于以上因素均与预后相关，因此联合检测NRP1、NRP2和MVD表达可能与预后相关，生存分析结果证实了此结论，即NRP1、NRP2和MVD高表达喉鳞癌患者的预后差。线性相关分析结果显示NRP1、NRP2和MVD具有协同正向作用，提示三者具有正向协同作用，NRP1、NRP2可能作为上游蛋白，具有直接调节CD34阳性的血管生成，其次NRP1、NRP2之间的作用也可能通过VEGF联系起来，通过脉管的激活与脉管的生成而发挥协同作用，因此NRP1和 CD34标记的MVD，NRP2和CD34标记的MVD均可能具有通路作用。而且NRP1、NRP2还可能参与鳞癌相关蛋白的增殖反应，或激活其他癌基因和转移相关基因，共同促进肿瘤的生长、侵袭和转移。

1 张 佳，张速勤，董 频，等.喉鳞癌组织中NRP-1、VEGF的表达变化及意义〔J〕.山东医药，2012;50(18):95-6.

2 张更琳，孔维佳.Neuropilin-1在喉癌组织及喉癌细胞系中的表达〔J〕.临床耳鼻咽喉科杂志，2006;20(14):634-5.

3 陈 洁，张红闯，宋晓萌，等.NRP1、NRP2及SEMA 3F在口腔癌组织及TCa、ACC细胞系中的表达及其可能的作用〔J〕.口腔医学，2009;29(5):235-7.

4 庆琳琳，李建生，师晓天.Neuropilin1在食管鳞癌中的表达及其意义〔J〕.胃肠病学和肝病学杂志，2005;14(4):386-8.

5 刘爱东，庞久玲，刘士生.胃癌中基质金属蛋白酶-9和CD105表达关系的研究〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(7):886-7.

6 Yang P，Yuan W，He J.Overexpression of EphA2，MMP-9，and MVDCD34 in hepatocellular carcinoma:Implications for tumor progression and prognosis〔J〕.Hepatol Res，2009;39(12):1169-77.

R739.65

A

1005-9202(2013)05-1037-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.05.022

焦胜敏(1972-)，女，硕士，高级讲师，副主任中医师，主要从事中西医结合治疗眼疾病研究。

〔2012-05-21收稿 2012-09-10修回〕

(编辑 张海彬)