手工进行酶联免疫吸附试验的影响因素

刘 威

手工进行酶联免疫吸附试验的影响因素

刘 威

长期从事血站血液检测项目，特别是手工操作酶联免疫吸附试验的过程中，发现其中诸多因素严重影响实验结果，并归纳总结出注意事项，以供同行参考。

酶联免疫吸附实验；影响因素

酶联免疫吸附试验（简称ELISA）是指酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。

在血站的血液检测项目中，除了转氨酶项目外，病毒检测均采用此方法，具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点。在没有大范围的使用核酸检测的今天，始终作为检测的唯一可靠的方法。

酶联免疫吸附实验由于它的敏感性，而使实验当中很多环节必须操作恰当、合理，才能保证实验的准确性。这些环节即可归纳成人、机、料、法、环，它们的影响至关重要。

1 人的因素

“人”是影响检验结果的首要因素；整个实验过程完全在人的操控下进行的，这就要求实验人员对实验步骤的熟练掌握和清晰的思路，不允许丝毫的马虎和懈怠，要有高度的责任心和道德心，过硬的实验技能、专业水平及应对实验中出现的问题和状况的分析与解决的能力，实验过程中不能带有个人情绪，不能因为生活琐事影响检验的操作，以至于涉及检验结果的核对和判断。

2 机的因素

“机”指的是仪器设备，它是顺利完成实验的关键环节，包括震荡仪、孵育箱、洗板机、酶标仪、加样器等。

2.1 所使用的仪器必须是有国家批准文号、并每年经过质检部门检定合格或厂家工程师定期维护正常，方能使用。

2.2 在实验进行前，应确保仪器的工作状态正常，事先预热。如孵育箱，在实验前达到理想温度；洗板机能否正常运行；酶标仪指示状态是否正常；加样器是否校准，在检定时间内使用。

2.3 仪器设备使用后，应进行维护和定期保养；如用75%的酒精擦拭，对于运行不畅的地方上润滑油等；有些设备需要日维护，有些设备需要周维护，有些设备需要月维护；有些设备需要定期更换灯管等（如生物安全柜）。

2.4 在实验过程中，发现仪器设备运行不正常应立即停止工作，上报总务科，与厂家工程师联系，制定维修方案。并及时贴上“停止使用”标识，最好移出工作空间，以免混用。

2.5 新引进和检修后的仪器设备使用前必须进行确认方可使用，并悬挂正常使用标识。

3 料的因素

“料”是指物料和试剂；物料应是有国家批准文号的，并经过计量检定达到标准的，是经久耐用型的；试剂应选用有国家批准文号并经过行业比对排名靠前的产品，尽量使用第四代产品，（抗原抗体联合检测）可缩短抗原抗体的检测时间；不同批号的试剂应分开存放，不宜交叉使用，试剂开启后要在一周内用完，并坚持优先使用上一盒试剂所剩余微孔的原则，不可有过期试剂出现在试剂库中[1]；从冰箱中取出的试剂盒必须放置30～60分钟复温至室温方可实验；新进的试剂必须在质控科室确认并贴有放行标识后方可进行试验。

4 法的因素

“法”即检测方法—酶联免疫吸附法（以下简称酶联法）；实验室人员应熟练掌握酶联法的原理、操作步骤、影响因素及注意事项，以便正确的操作；其中包括标本的处理、加样、震荡、孵育、洗板、显色、终止等。

4.1 实验室人员收到标本后应认真查对，对于不够量、中重度乳糜、溶血、有凝块、标识不清的标本拒收，并在质控部门的监督下重新留样。对于合格标本要及时分离血清，离心2500转10分钟，避免溶血，对于不能及时检测的标本应妥善保存于4℃冰箱，和交接单一起保存。实验前务必复温至室温方可实验检测；ELISA检测尽量采用新鲜标本，长时间冻存的样本避免反复融冻[2]。

4.2 仔细阅读说明书以了解实验中的操作步骤和注意事项，以确定阴性、阳性的孔数、位置和加样量，反应孵育温度和孵育时间、洗涤的次数，显色时间及终止等。

4.3 加样过程中，必须使用检定合格的加样器，并垂直加样，不可外溢或挂壁，影响加样量，导致结果偏低；加样吸头不可反复使用，以免造成污染。

4.4 震荡，加样结束后必须用震荡仪进行震荡，使其充分混合（有稀释液的）幅度不可过大，以免造成样本外溅。

4.5 洗涤次数不要超过说明书推荐的次数，洗液在反应孔内滞留的时间不宜过长；洗涤后拍板应尽量干净，避免孔内有液体残留，造成花板。

4.6 在加酶或显色液时不可使用塑料滴管，应使用加样器，塑料滴管的量不准确（和加样器大约相差20%左右），而且不宜控制，造成显色不统一，判断错误。

4.7 在孵育过程中应用不干胶纸覆盖板的表面，以防止污染和保持温度；尽量使用有单独小门的孵育设备，以避免多人多次开关孵育箱使孵育箱内的温度下降，严密监控孵育时间，时间的过长或过短都会导致结果的不准确。

4.8 加显色液时，不能在处于阳光直射的环境下，加显色系统后要避光反应，以免显色过强；显色时间严格按照说明书要求，过长会使颜色加深，过短会使反应不完全，尤其是弱阳性。

4.9 在每次实验中，必须加入室内质控对照，与检测样品相同的条件进行，以监控实验的成功与否。

4.10 洗液必须当天配制，当天使用，不可和其它厂家的洗液混用，严格按照说明书上的配制比例配制，使用后有剩余的应弃去，以防止细菌污染。

5 环的因素

这里的“环”是指实验中所处的环境，是实验进行的基础，也是保证实验成功的前提。应对实验的物理参数有充分的了解，如环境温度（保持在18℃～25℃）、湿度（保持在30%～70%），并使用空调、加湿器等设备以控制其在适合的范围内；环境应通风（门窗应有防蚊防蝇设施）、宽敞、视线良好、地面防滑、试验台耐酸耐碱、有消防器材和措施、有洗眼设施并能采取必要的防护等。

在长期的实验过程中，发现了上述诸多的影响因素，如果忽视了它，难免会造成假阴性或假阳性，了解并能够很好的控制它是避免差错事故的必要手段。

[1] 张化涛,段延安.影响酶联免疫检测因素的分析[J].实用医技杂志,2011(7).

[2] 李会英.酶联免疫吸附实验影响因素的分析[J].检验医学与临床,2007,4(10)： 985-986.

R331

A

1673-5846(2013)06-0297-02

吉林省辽源市中心血站，吉林辽源 136200