碳氮源对植物乳杆菌L69发酵羊奶产ACE抑制肽的影响

陈 合, 张秋红, 田 悦, 王 娟, 舒国伟

(陕西科技大学 生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

乳杆菌属细菌是一类广泛应用于食品发酵、工业乳酸生产及医疗保健等领域，与人类生活密切相关的有益微生物[1,2].植物乳杆菌(L.plantannn)是乳酸杆菌中的一种，因多数从植物中分离得到而得名.最适生长温度为30 ℃～35 ℃，兼性厌氧，最适pH值6．5左右.植物乳杆菌无论是在食品发酵，还是工业乳酸发酵以及民疗保健等领域中均有着广泛的应用[3].

ACE抑制肽即血管紧张素转换酶抑制肽，是一类由蛋白质经酶解而产生的具有ACE抑制活性的多肽类物质，通常含有3～10个氨基酸残基，分子量通常在300～10 000之间[4]，可以快速通过消化粘膜进入血液循环，与ACE强效结合从而抑制其活性，具有降压的作用.ACE是一种膜结合的二肽羧基多功能酶，是一种糖蛋白，含有维持其活性所必需的Zn2+和Cl-，广泛存在于人体组织及血浆中，在肺毛细管内皮细胞的含量最为丰富[5-7].ACE作用于体内的肾素——血管紧张素系统(Renin-Angiotensin System，RAS)和激肽释放酶——激肽系统(Kallikrein-Kinin System，KKS)，对血压的调节起着重要的作用[8].

近年来，国外有许多关于发酵法制备乳源ACE 抑制肽的研究报道，最早Yamamoto[9]等研究得出瑞士乳杆菌发酵乳中的ACE 抑制肽含量及活性高于其它乳酸菌.本研究主要以植物乳杆菌在复原羊乳中发酵，通过在羊乳中添加不同的酪蛋白、乳糖、葡萄糖和大豆蛋白胨等确定LactobacillusPlantarumL69发酵羊奶产ACE抑制肽的4种物质的最佳添加量，为研制高ACE抑制活性的乳产品提供理论依据和技术支撑.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种及培养基

植物乳杆菌，分离自内蒙古酸奶样品，陕西科技大学生命科学与工程学院1C-419研究室保存.

MRS培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母浸粉4，蛋白胨10，牛肉膏8，乙酸钠5，柠檬酸二铵2，磷酸氢二钾2， MgSO42，MnSO44，吐温-80 1 mL.118 ℃灭菌15 min.

1.1.2 主要试剂与仪器

蔗糖，乳糖、脱脂乳粉和抗坏血酸钠及MRS培养基中的试剂均为生化试剂.恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；鼓风干燥箱： 天津泰斯特仪器有限公司；SW-CJ-1F 无菌操作台：苏州净化；DH5000AB 电手提式蒸汽压力灭菌器：江阴滨江医疗器械厂；LG10-2.4离心机：北京医用离心机厂；UV-5300PC型紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司；PB-10酸度计：赛多利斯(北京)科技有限公司.

1.2 试验方法

1.2.1 植物乳杆菌的活化及发酵剂的制备

将植物乳杆菌5%接种于MRS培养基中，连续活化三次，活化好的菌种5%转接到14% 的灭菌复原羊乳中，37 ℃条件下培养12 h，连续转接三次，制成发酵剂.

1.2.2 植物乳杆菌发酵乳的制备

将复原羊奶配置成14%浓度，分别添加上述物质，按5%(v/v)接种量接入发酵剂，37 ℃下培养16 h，取样测定其生物量(活菌数)、酸度、pH以及ACE抑制率.

1.3 测定方法

1.3.1 活菌数测定

平板涂布法，将样品震荡混匀，用稀释液依次做10倍递增稀释至10-8，选择适宜的稀释度，稀释后取0.1 mL稀释液均匀接种在MRS固体培养基上，涂布均匀后于37 ℃培养48 h，选菌落数为30～300个之间的平板，每个样品选两个稀释度，每个稀释度做两个复本求均值，计算活菌数(CFU/mL表示).

1.3.2 酸度测定

氢氧化钠滴定法，以吉尔涅尔度(°T)表示[10].取5 mL发酵液注入容量为100 mL的三角瓶中，用10 mL蒸馏水稀释，加入2～3滴1%酚酞指示剂，用0.l mol/L NaOH标准溶液滴定.

1.3.3 pH值的测定

pHs-3c酸度计室温下测定[11].

1.3.4 ACE抑制率测定

Cushman和Cheung的方法[12].

用含有0.3 mol/L NaCl的0.1 mol/L硼酸盐缓冲液(pH8.3)将HHL(Hip-His-Leu)配成5.0 mmol/L的溶液.在10 mL试管中分别加入200μL的5 mmol Hip-His-Leu溶液和100μL的发酵乳上清液，于37 ℃下保温5 min后，再加入20μL ACE溶液(溶解于蒸馏水中，活力为0.1 U/mL)，混匀后37 ℃下保温30 min，加入250μL 1 mol/L HCl终止反应，再加入1.7 mL醋酸乙酯，经15 s振荡混匀后，静置5 min，用移液管吸取1.0 mL 的醋酸乙酯层于另一干净小瓶，于120 ℃环境中烘干30 min后，取出加入2.0 mL蒸馏水，混匀后于228 nm处测定吸光度.测定过程有三次平行实验，ACE抑制肽对ACE的抑制率用以下面公式计算.

ACE抑制率=[(B-A)/(B-C)] ×100%

(1)

式中：A—a组的吸光度值，a组中，发酵羊乳乳清样品与ACE、HHL同时反应；B—b组的吸光度值，b组在反应中不加入发酵羊乳乳清样品， ACE与HHL完全反应；C—c组的吸光度值，c组在反应前先使ACE失活，作为ACE与HHL反应的空白组.

2 结果与讨论

2.1 酪蛋白对植物乳杆菌L69发酵羊乳生产ACE抑制肽的影响

将酪蛋白分别以0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%的添加量加入到14%的复原羊乳中，90 ℃杀菌15 min，再以5%的接种量接入植物乳杆菌，混匀后于37 ℃恒温培养18 h，测定其滴定酸度、pH值、ACE抑制率和活菌数.结果如图1及图2所示.

从图1、2中可以看出，在0.1%～0.5%酪蛋白浓度范围内，发酵羊乳pH逐渐下降，滴定酸度逐渐上升.当酪蛋白浓度达到0.4%时，pH值和滴定酸度变化趋势趋于平缓；随着酪蛋白浓度的增大，活菌数和ACE抑制率的变化呈现出相反趋势.在0.1%～0.4%的酪蛋白浓度范围内，植物乳杆菌的活菌数呈缓慢上升趋势，在酪蛋白质量浓度0.4%时达到最大值.而ACE抑制率在0.2%～0.5%酪蛋白质量浓度范围内呈下降趋势，0.2%时处于ACE抑制率最大值，此时发酵产物中的小肽作为底物可能被植物乳杆菌重新利用，导致发酵产物中的小肽含量降低，从而导致了ACE抑制率的降低.姜瞻梅等[13]研究发现随着添加酪蛋白量的增加，ACE抑制活性逐渐增强，原因在于发酵菌株和牛羊奶中酪蛋白含量的不同造成的差异.

图1 酪蛋白对酸度和pH的影响

图2 酪蛋白对ACE抑制活性的影响

2.2 乳糖对植物乳杆菌L69发酵羊乳生产ACE抑制肽的影响

将乳糖分别以0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%的添加量加入到复原羊乳中，其它条件同2.1.结果如图3及图4所示.

图3 乳糖对酸度和pH的影响

可以看出，活菌数随着乳糖浓度的升高先增大后减小，在0.5%浓度处达到最大值.发酵羊乳的ACE抑制率先缓慢上升，自0.7%浓度处缓慢下降，表明乳糖浓度变化对植物乳杆菌发酵羊乳产生ACE抑制肽无明显的促进作用.

图4 乳糖对ACE抑制活性的影响

2.3 葡萄糖对植物乳杆菌L69发酵羊乳生产ACE抑制肽的影响

将葡萄糖分别以0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%的添加量加入到14%的复原羊乳中，其它条件同2.1.结果如图5及图6所示.

图5 葡萄糖对酸度和pH的影响

图6 葡糖糖对ACE抑制活性的影响

从图5、6得知，植物乳杆菌的活菌数随葡萄糖浓度的增加而呈现增大的趋势，在0.7%浓度处达到最高值，之后趋于稳定.表明葡萄糖浓度的逐渐升高对植物乳杆菌的生长有一定的促进作用，发酵羊乳的ACE抑制率随着葡萄糖浓度的增大也相应提高，表明葡萄糖浓度的变化对菌体的糖代谢作用产生了影响，进而促进了蛋白酶的水解.

2.4 大豆蛋白胨对植物乳杆菌L69发酵羊乳生产ACE抑制肽的影响

将大豆蛋白胨分别以0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%的添加量加入到14%的复原羊乳中，其它条件同2.1.结果如图7及图8所示.

图7 大豆蛋白胨对酸度和pH的影响

图8 大豆蛋白胨对ACE抑制活性的影响

可以看出，发酵羊乳的酸度随着大豆蛋白胨浓度的增大而增大，表明大豆蛋白胨浓度的提高对植物乳杆菌的产酸有促进作用；发酵羊乳中的活菌数随着大豆蛋白胨浓度的增大而增大.ACE抑制率先增大后减小，在0.5%浓度处达到最大值88.7%.表明加入大豆蛋白胨增加了可被水解生成ACE抑制肽的蛋白含量，使得ACE抑制率在一定范围内呈上升趋势，而在0.5%浓度之后ACE抑制率呈下降趋势，此时羊乳中蛋白质总量的增加，蛋白酶水解蛋白质不完全所致.

3 结束语

植物乳杆菌L69发酵羊乳制备ACE抑制肽的碳氮物最适浓度分别为酪蛋白0.2%、乳糖0.7%、葡萄糖0.9%、大豆蛋白胨0.5%.ACE抑制率可分别达74.5%、76.36%、89.12%、88.70%，对照组为68.38%，添加酪蛋白、乳糖、葡萄糖和大豆蛋白胨对植物乳杆菌产ACE抑制肽均有较为显著的影响；活菌数和ACE抑制肽抑制率之间没有相关性.

[1] 杨洁彬,郭兴华,张 篪,等.乳酸菌-生物学基础及应用[M].北京：中国轻工业出版社,1996.

[2] 凌代文,东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京：中国轻工业出版社,1999.

[3] 王水泉,包 艳,董喜梅.等植物乳杆菌的生理功能及应用[J].屮国农业科技导报,2010,12(4)：49-55.

[4] 吴 玲，潘道东.发酵乳抗高血压特性的研究[J]．食品科学，2005,26(9)：446-449.

[5] 赵海珍.天然食品来源的血管紧张素转换酶抑制肽的研究进展[J].中国生化药物杂志,2004,25(5):315-317.

[6] 尤 新.功能性发酵制品[M].北京:中国轻工业出版社, 2000.

[7] 何海伦,陈秀兰,孙彩云,等.血管紧张素转化酶抑制肽的研究进展[J].中国生物工程杂志,2004,24(9):7-11.

[8] 姜瞻梅,霍贵成,吕桂善.不同食物来源的ACE抑制肤的研究现状[J].食品研究与开发,2003,24(1):27-29.

[9] Yamamoto N，Akino A，Takano T.Antihypertensive effect of the peptides derived from casein by an extracellular proteinase from lactobacillus helveticus CP790[J].Dairy Science,1994,77: 917-922.

[10] 张伯琛,刘增然,梁斐斐,等.强化益生发酵奶的研制[J].食品科学,2008,29(11)：741-744.

[11] GB2746-1999，酸牛乳乳和乳制品国家标准应用指南[S]．

[12] Cushman D W, Cheung H S. Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung[J].Biochem. Pharmacol,1971,20:1 637-1 648.

[13] 姜瞻梅,吴 刚,霍贵成,等.发酵乳中ACE抑制肽生成的外部因素条件的研究[J].食品工业科技,2011,32(4):106-108.