正交法优化保加利亚乳杆菌冻干保护剂

陈 合， 李串娜， 舒国伟， 罗 茜

(陕西科技大学 生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

保加利亚乳杆菌属于革兰氏阳性，厌氧细菌.单个个体成长杆状或链状，两端椭圆，不具运动性，也不会产生孢子.它属于化能异养型微生物，最适生长温度一般为37～45 ℃，温度高于50 ℃或低于20 ℃则不能生长.

保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus,LB)是有益于人体健康的益生菌之一[1]，主要存在于人体肠道，可降低肠道内的pH值，抑制肠道中腐败菌的生长并减弱腐败菌在肠道内的产毒作用，防治细胞老化，降低胆固醇及调节人体生理机能等医疗保健作用.因此，正受到越来越多消费者的欢迎和喜爱[2-4].

目前，冻干菌粉的制备多采用真空冷冻干燥法[5].但其中冷冻和干燥两个过程均会造成微生物细胞不同程度的损伤、死亡及某些酶蛋白的钝化.如果菌体直接进行冷冻干燥，存活率只有10～30%左右[6-8]，若将菌体悬浮于适宜的介质中再进行冷冻干燥，菌体的存活率可达到70%以上.因此，选择合适的冻干保护剂非常必要.

保护剂可以改变生物样品冷冻干燥时的物理、化学环境，减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害，尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性[9,10].冻干保护剂不仅影响乳酸菌在冻干过程中的细胞存活率，还影响保藏期间的细胞稳定性[11].

正交试验设计是使用正交表来安排多因素多水平试验，并采用统计学方法分析结果的一种实验设计方法.它不仅可以解决多因素选优问题，而且还可以用来分析各因素对试验结果影响的大小，从而找出主要因素.

本课题组在前期通过Plackett-Burman试验设计优化筛选了对保加利亚乳杆菌生长影响较为显著的几种氮源，初步确定了3种氮源的添加量[8].本研究则通过单因素实验研究了乳糖、脱脂乳粉、蔗糖和抗坏血酸钠等4种物质对该菌的冻干存活率及菌粉活菌数的影响；在此基础上，并采用正交实验对保加利亚乳杆菌的抗冻保护剂进行了优化，从而为保加利亚乳杆菌冻干菌粉的生产提供了一定的参考依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种及培养基

MRS培养基(g/100mL)：葡萄糖2，蛋白胨1，牛肉膏0.8，酵母浸粉0.4，柠檬酸二铵0.2，磷酸氢二钾0.2，乙酸钠0.5，MgSO40.02，MnSO40.004，吐温-80 0.1 mL.

118 ℃灭菌15 min，用于菌种的活化、培养及计数.

1.1.2 主要试剂与仪器

试剂：蔗糖，乳糖、脱脂乳粉和抗坏血酸钠及以上MRS培养基中所用试剂均为生化试剂级.

仪器：SW-CJ-1F 无菌操作台，苏州净化；DH5000AB 电热恒温培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司；手提式蒸汽压力灭菌器，江阴滨江医疗器械厂；电热鼓风干燥箱，天津泰斯特仪器有限公司；LG10-2.4离心机，北京医用离心机厂；FD-1D-50真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；离心机，北京医用离心机厂.

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程

菌种活化→菌种培养→离心收集菌泥→加保护剂→预冻→真空冷冻(24 h)→复水→活菌计数.

1.2.2 菌种活化

将LB以2%的接种量接种于MRS培养基中，活化三次，镜检无杂菌后，置于4 ℃冰箱保存.

1.2.3 菌体培养及收集

将活化好的LB以4%(V/V)接种量接种于MRS培养基中，37 ℃培养18 h.然后将培养液置于离心管中，以8 000 r/min的转速离心15 min，倒掉上清液，从而获得菌泥.

1.2.4 冷冻干燥工艺

向菌泥中加入保护剂后，于-40 ℃冰箱内预冻4 h，然后置于真空冷冻干燥机内，于-51 ℃、6.93 Pa下冻干24 h.

1.3 测定方法

1.3.1 菌体形态观察

采用甲苯胺蓝染色法：在涂片上滴加0.2%的甲苯胺蓝染色液，酒精灯上稍加热后移开，置于室温下染色2 min 后水洗，然后用1%的乙酸脱色1～2 s 后用水冲去，用滤纸吸干周围多余的水分或自然干燥后镜检.

1.3.2 活菌数测定

(1)冷冻干燥前对菌悬液进行活菌计数.(2)冷冻干燥后，用30 mL灭菌后的生理盐水复水冻干菌粉再进行活菌计数.通过梯度稀释法，将菌悬液适当稀释，选择合适的稀释度取0.1 mL接种于MRS计数培养基中，涂布均匀后，于37 ℃培48～72 h后，选30～300个之间的菌落数进行活菌计数，每个稀释度做三个求均值.

1.3.3 存活率和菌粉活菌数计算

存活率(%)=冻干后总活菌计数/冻干前总活菌计数×100%

菌粉活菌数(cfu/g)=冻干后总活菌数×菌悬液体积/菌粉重

2 结果与分析

2.1 蔗糖对保加利亚乳杆菌冻干效果的影响

保加利亚乳杆菌经过三次活化后，在37 ℃恒温箱中培养18 h，然后于8 000 r/min、离心15 min，倒掉上清液，获得菌泥，向菌泥中加入蔗糖保护剂，使蔗糖浓度分别为5%、10%、15%、20%、25%，并补充磷酸缓冲液使添加物总量与菌泥等重，预冻后进行冻干.冻干存活率与菌粉活菌数如图1所示.

图1 蔗糖对保加利亚乳杆菌冻干的影响

从图1中可以看出，随着蔗糖浓度的增加，保加利亚乳杆菌的存活率不断增加，菌粉活菌数先减小后增加，当蔗糖浓度达到25%时，菌体的存活率为24.5%，菌粉活菌数达到0.692×1011cfu/g.

2.2 乳糖对保加利亚乳杆菌冻干效果的影响

保加利亚乳杆菌经活化，培养后离心获得菌泥，再加入乳糖，使乳糖浓度分别为5%、10%、15%、20%、25%，并补充磷酸缓冲液，冻干后结果如图2所示.

图2 乳糖对保加利亚乳杆菌冻干的影响

从图2可以看出，保加利亚乳杆菌存活率和菌粉活菌数随着乳糖浓度的变化而变化，当乳糖浓度达到20%时，菌体存活率达到最高值35.6%；当乳糖浓度25%时，菌粉活菌数达到最大值为0.983×1011cfu/g.

2.3 脱脂乳粉对保加利亚乳杆菌冻干效果的影响

保加利亚乳杆菌经活化后，培养离心获得菌泥，再加入脱脂乳粉，使脱脂乳粉浓度分别为5%、10%、15%、20%、25%，并补充磷酸缓冲液，冻干后结果如图3所示.

从图3可以看出，随着脱脂乳粉浓度的变化，保加利亚乳杆菌存活率和活菌数随之变化，当脱脂乳粉浓度达到25%时，菌体存活率达到最大值64.4%；当脱脂乳粉浓度20%时，菌粉活菌数达最大值1.68×1011cfu/g.

图3 脱脂乳粉对保加利亚乳杆菌冻干的影响

2.4 抗坏血酸钠对保加利亚乳杆菌冻干效果的影响

保加利亚乳杆菌经活化后，培养离心获得菌泥，加入抗坏血酸钠，设置抗坏血酸钠浓度分别为1.5%、3.0%、4.5%、6.0%、7.5%，并补充磷酸缓冲液，使添加物总量与菌泥等重，冻干后结果如图4所示.

图4 抗坏血酸钠对保加利亚乳杆菌冻干的影响

从图4中可以看出，当抗坏血酸钠浓度达到4.5%时，保加利亚乳杆菌的存活率和活菌数均达到最大值84.7%和0.51×1011cfu/g，因此，4.5%的抗坏血酸钠浓度在保加利亚乳杆菌冻干过程中，保护效果最好.

2.5 最佳冻干保护剂的确定

在单因素的基础上，采用四因素三水平试验设计，对蔗糖(A)、乳糖(B)、脱脂乳粉(C)和抗坏血酸钠(D)4个因素进行考察，分析筛选出影响较大的因素及最佳冻干保护剂配方，各种保护剂水平设计见表1，其响应值Y为保加利亚乳杆菌存活率，Y′为保加利亚乳杆菌菌粉活菌数(×1011cfu/g).试验设计和结果见表1.

表1 正交试验设计及结果

由表1极差R、R′分析可知，4种保护剂对菌种存活率及活菌数影响的主次因素是一致的，由大到小顺序为A>C>D>B，即蔗糖对存活率和活菌数影响最大，其次是脱脂乳粉、抗坏血酸钠、乳糖.

根据极差分析，存活率及活菌数最高组的最佳组合为A1B2C2D3，因为这个组合不在已做的9次试验中，所以又做了A1B2C2D3进行了验证.发现保加利亚乳杆菌的存活率为94%，菌粉的活菌数为1.926×1011cfu/g，均高于表1中的存活率和菌粉活菌数，所以最佳组合为A1B2C2D3，即最佳冻干保护剂配方为:30%蔗糖+20%脱脂乳+4.0%抗坏血酸钠+20%乳糖.

3 结论

保加利亚乳杆菌的最佳保护剂配方为：30%蔗糖+20%脱脂乳粉+4.0%抗坏血酸钠+20%乳糖.该复配保护剂能使保加利亚乳杆菌在真空冷冻干燥中的存活率达到94%，菌粉的活菌数达1.926×1011cfu/g.

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