酶法改性处理对大豆蛋白性质的影响

董文宾, 赵莹莹

(陕西科技大学 生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

大豆蛋白是一种优质的植物蛋白资源，它在食品中的可应用性不仅依赖于它的营养性，还依赖于它的功能性.凝胶性是大豆蛋白最重要的功能特性之一，许多大豆食品的加工就是利用大豆蛋白的凝胶化来制作的.大豆蛋白的适度变性是形成凝胶的基础[1]，已有研究表明通过对大豆蛋白进行改性处理，可以改变蛋白质的空间结构，进而改善大豆蛋白的溶解性.

在许多大豆制品的传统生产工艺中，主要是通过对大豆蛋白进行热处理来达到大豆蛋白变性的目的.有研究表明，大豆蛋白的改性方法可以分为物理改性、化学改性和酶法改性[2].其中，酶法改性是通过酶降解蛋白质来改变蛋白质的功能特性，且酶法改性具有物理、化学改性等无可比拟的优点：如营养价值不会降低、反应条件温和、作用具有独特专一性、反应进程容易控制、无不良副反应和总体安全等[3].据文献[4]报道，一些蛋白酶还具有使大豆浆料凝固的能力，因此本文采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶对大豆浆料进行酶解改性，研究其对大豆蛋白性质的影响.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料：大豆，市售；木瓜蛋白酶，北京奥博星生物技术有限责任公司；AS1.398中性蛋白酶，西安沃尔森生物技术有限公司；血红素标准品，Alfa Aesar公司，纯度99%；葡萄糖酸内酯(GDL，Glucono-Delta-Lactone葡萄糖酸-δ-内酯).

主要仪器：PHS-3C精密pH计，上海精密科学仪器有限公司；JJ-1精密增力电动搅拌器，常州国华电器有限公司；TDL-40B离心机，上海安亭科学仪器厂；UV-2600紫外可见分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司；KDN-04C型数显消化炉、KDN-04C型凯氏定氮仪，上海洪纪仪器设备有限公司；TA-XT Plus质构仪，英国Stable Micro System公司；SD-Basic喷雾干燥仪，英国Labplant公司.

1.2 实验方法

1.2.1 大豆浆料的制备

制备过程为：大豆原料→磨浆→煮浆→调配均质[5]→调pH→酶解→不同水解度的酶解液→喷雾干燥制粉→测NSI值.

将浸泡过的大豆以1∶10的料水比进行磨浆[6,7]，用尼龙布过滤后得大豆浆料.将制得的大豆浆料在95 ℃水浴条件下热处理10 min，并调配至所需的pH值.加入一定量的蛋白酶进行酶解，并采用pH-stat法[8]控制体系的pH值，根据滴加的碱量控制所需制备的水解度.

将制得的不同水解度的水解样品加入一定量的GDL制成凝胶之后，测定其凝胶强度和凝胶失水率；将不同水解度的水解样品进行喷雾干燥制粉，喷雾干燥条件[9,10]设定为：进风温度150 ℃，出风温度80 ℃，然后测定其NSI值.

1.2.2 蛋白酶酶活力的测定

采用福林显色法测定蛋白酶活力.福林-酚试剂在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应.蛋白质中具有含有酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)，因此，蛋白质及其水解产物也易被酚类化合物还原呈蓝色反应.福林显色法就是利用蛋白酶分解酪素(底物)生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力.

一个酶活力单位定义为1 g固体酶粉(或1 mL液体酶)，在40 ℃(酸性pH=3.0、中性pH=7.5、碱性pH=10.5)的条件下，1 min水解酪素产生1μg酪氨酸的酶量.

蛋白酶的活力=A×K×4/10×nμ/g

式中，A：样品平行试验的平均OD值;K：吸光常数;4：反应试剂的总体积;10：酶解反应时间;n：酶液稀释总倍数.

1.2.3 凝胶强度的测定

质构仪测豆腐脑凝胶强度.探头型号：P/0.5；测前速度：1 mm/sec；测试速度：2 mm/sec；侧后速度：1 mm/sec；探头下降深度：8 mm/sec.使凝胶破碎的最大力为凝胶强度，单位是g.每个样品测3个平行.

1.2.4 凝胶失水率的测定

将测过凝胶强度的豆腐脑取一定量放入离心管中，放入4 000 r/min的离心机中离心5 min，然后倾出离心管内游离水分，并用滤纸小心将管内吸附于离心管壁处的可见水分吸出，称重.

失水率W(%)=(W1-W2)/W1×100

式中，W1：离心前豆腐脑的重量(g)；W2：离心后豆腐脑的重量(g).

1.2.5 大豆蛋白溶解性NSI的测定

准确称取0.50 g豆腐脑粉，加30 mL蒸馏水，用磁力搅拌器搅拌1 h，然后移至50 mL容量瓶中定容.静置30 min后，取上清液于离心管中，放入1 500 r/min的离心机中离心10 min，将离心所得上清液进行消化定氮.以氮溶指数NSI表示大豆蛋白的溶解性.

2 结果与分析

2.1 蛋白水解酶的相关性质

研究表明，动物蛋白酶、植物蛋白酶以及微生物蛋白酶都可以水解大豆蛋白以提高其功能特性[11].但考虑到动物蛋白酶价格昂贵、副反应多，工业生产大多选用植物蛋白酶和微生物蛋白酶.所以，本文采用木瓜蛋白酶和AS1.398中性蛋白酶这两种酶源进行研究，其相关性质见表1.

表1 两种蛋白水解酶的相关性质

由图1可得酶活标准曲线方程为：y=0.009 3x+0.004 8，R2=0.998 7.从直线的斜率计算K值：K=107.01，由此可得两种蛋白酶的酶活.在实验条件下测得的两种蛋白酶的酶活见表2.

图1 蛋白酶酶活标准曲线

表2 两种蛋白酶的酶活

2.2 不同水解度对凝胶强度影响

由图2、图3可知，不同水解度样品的凝胶强度比未经水解样品的凝胶强度低很多.由此可见，蛋白酶的水解作用对大豆蛋白的凝胶性能是不利的.这可能是因为随着酶解作用的进行，浆料中的大分子蛋白质的肽链逐渐变短，而较短的肽链转动自由度比较大，空间位阻也比较小，使得肽链之间相互缠绕形成网络结构的能力就比较弱，因此导致凝胶强度也降低.由图可知，在蛋白酶的水解样品中，凝胶强度随水解度的增大变化幅度不大.

图2 木瓜蛋白酶对凝胶性能的影响

图3 中性蛋白酶对凝胶性能的影响

2.3 不同水解度对凝胶失水率的影响

由图4可知，在木瓜蛋白酶的水解初期，随着水解度的增大，大豆蛋白的凝胶失水率呈逐渐降低的趋势，但波动不大.当水解度DH>4%时，凝胶失水率增大幅度加剧；由图5可知，在中性蛋白酶的水解初期，随着水解度的增加，凝胶失水率逐渐增大，当水解度DH>6%时，凝胶失水率增大幅度加剧.

图4 木瓜蛋白酶对凝胶失水率的影响

图5 中性蛋白酶对凝胶失水率的影响

凝胶失水率在水解样品达到一定水解度之后急剧增大的原因可能是因为随着水解作用的增强，蛋白质分子变性程度逐渐增强，产生的较短肽链形成网络结构的能力比较差，使得凝胶的保水性变弱.

2.4 不同水解度对溶解性的影响

由图6、图7可知，蛋白酶水解样品的大豆蛋白溶解性比未水解样大很多.两种蛋白酶的水解样品随着水解度的增大，大豆蛋白的溶解性变化都比较复杂，但整体呈现上升的趋势.

图6 木瓜蛋白酶对大豆蛋白溶解性的影响

图7 中性蛋白酶对大豆蛋白溶解性的影响

大豆蛋白溶解性随着水解度的增大而增大的原因，可能是因为蛋白酶的水解使大豆浆料中的大分子蛋白质水解成了小分子肽类和氨基酸，而小分子的肽类和氨基酸易溶于水.过度水解虽然在很大程度上缩短了肽链长度，增加了大豆蛋白的溶解性，但同时也使埋藏在长肽链结构内部的疏水性氨基酸大量暴露而导致苦味的产生，这对于食品饮料而言是不能接受的.因此，要想得到无苦味、凝胶性能较好，且溶解性也较好的产品，只能对大豆蛋白质进行限制性的轻度水解[12].

3 结论

从实验结果可以看出，采用蛋白酶水解热处理后的大豆浆料，进行限制性酶解后得到的大豆蛋白的NSI值都得到了很大地提高，相对未经水解的样品提高了40%左右，显著提高了大豆蛋白的溶解性.

但考虑到水解度对凝胶保水性的影响，木瓜蛋白酶选择的最佳水解度为DH=2%，此时的NSI=81.22%，相对未经水解的样品提高了45.63%；中性蛋白酶选择的最佳水解度为DH=2%，此时的NSI=68.27%，相对未经水解的样品提高了32.68%.

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