红毛七中三萜皂苷类化学成分生物活性研究

杨秀芳, 马养民， 邢 华， 刘建军， 康永祥

(1.陕西科技大学 教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室 化学与化工学院， 陕西 西安 710021； 2.西北农林科技大学 林学院， 陕西 杨凌 712100)

0 引言

红毛七(CaulophyllumrobustumMaxim.)为小檗科红毛七属植物，主产于我国的东北地区、甘肃、陕西、四川 等地[1].其根及根茎是药用部位，可以栽培，红毛七具有很强的活血化瘀，祛风通络等作用[2].在民间可以用来治疗风湿疼痛、类风湿、胃腹疼痛、跌打损伤、月经不调、关节炎等病[3].

为进一步明确红毛七药理活性与其化学成分的构效关系，本文对陕西太白山产红毛七中分离得到的化合物抑菌活性、镇痛活性和抗炎活性等进行研究，期望从中获得生物活性比较好的化合物，为开发利用红毛七提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 样品

以采自陕西太白山红毛七分离纯化得到的α-菠菜甾醇、16α-羟基-齐墩果-12-烯-28-酸-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷、常春藤皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷、葳严仙皂苷元-3-O-α-LV阿拉伯吡喃糖苷、常春藤皂苷元-3-O-β-D-V葡萄吡喃糖- (1→2)-α-L-阿拉伯吡喃糖苷[4]为测试样品.

1.1.2 供试菌种

细菌:金色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、乳链球菌(Streptococcusthermophilus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)

植物病原真菌：小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)、葡萄炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides).

1.1.3 动物

雄性昆明种小鼠，18～22 g，由第四军医大学实验动物房提供(合格证号：SCXK(军)2007-007).

1.1.4 仪器

SW-CJ-1FD超净工作台、YX280B手提式压力蒸汽灭菌锅、101-1型干燥箱、DH5000B电热恒温培养箱、HZQ-Q全温振荡器、血球计数板、BS224S分析天平.

1.2 实验方法

1.2.1 测试液的配制

将分离得到化合物1、2、3、4、5等五个纯品化合物，分别用二甲基亚砜(DMSO)配成1.0 mg/mL，灭菌后置入超净工作台中备用.

1.2.2 菌液制备

将在固体培养基上培养的大肠杆菌(E.c)、乳链球菌(S.t)、金黄色葡萄球菌(S.a)、枯草芽孢杆菌(B.s)、小麦赤霉病菌(F.g)、白菜黑斑病菌(A.b.)、西瓜枯萎病菌(F.o.n)、葡萄炭疽病菌(C.g)从恒温培养箱中取出，在杀菌后的超净工作台上将以上各菌接种至配制好的液体培养基中，再将接菌后的液体培养基转移至全温振荡器，温度恒定在28 ℃培养48 h，备用[5].

1.2.3 最小抑菌浓度(MIC)的测定

(1)取紫外消毒的96孔板，竖排依次编号A、B、C、D、E、F、G，横排依次编号1、2、3、4、5、6、7、8(编号为A1、 A2、 A3、 A4、 A5、 A6、 A7、A8，B1-B8……F1-F8，G1-G8).选取一种稀释过的菌悬液，在杀菌后的超净工作台上，用移液枪吸取100μL菌悬液放置在板孔中，重复此操作，在编号的孔板注入100μL菌悬液.

(2)在杀菌后的超净工作台上，将按1.2.1章节所述方法配制好的α-菠菜甾醇样品，用移液枪吸取100μL注入在已有菌悬液的A1孔中、混匀.待菌悬液与α-菠菜甾醇样品混匀后，再用移液枪从A1孔中吸取混合液体100μL，注入A2孔中，依次进行倍半稀释，将A1-A8孔分别注入.最后，从A8孔中吸取出100μL混合溶液，弃掉.经过此步操作，A1-A8孔中均剩余100μL混合溶液，α-菠菜甾醇样品浓度依次为500μg/mL，250μg/mL，125μg/mL，62.5μg/mL，31.3μg/mL，15.6μg/mL，7.8μg/mL，3.9μg/mL.

(3)按照步骤(2)的操作，将B1-B8注入16α-羟基-齐墩果-12-烯-28-酸-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷，C1-C8注入常春藤皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷，D1-D8注入葳严仙皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷，E1-E8注入常春藤皂苷元-3-O-β-D-葡萄吡喃糖- (1→2)-α-L-阿拉伯吡喃糖苷，F1-F8注入对照样品，细菌以硫酸卡那霉素(CK1)和青霉素钠(CK2)作为阳性对照，真菌以酮康唑(CK3)作为阳性对照，G1-G8为空白对照.

(4)再取96孔板，按照步骤(1)至(3)把各个测试菌与各个测试样品混合，完成后，将注入待测样品与菌悬液的96孔板放入电热恒温培养箱中，温度恒定在28 ℃培养24 h.用酶标仪测各个板孔的透光度，再由透光度来计算各个样品的抑制率[6].

式中：P-抑制率，K0-溶剂对照孔，K1-样品孔 ，K2-空白对照孔.

1.2.4 镇痛活性测定

取雄性昆明小鼠48只，随机分成8组，每组6只.采用热板法进行镇痛活性试验，其中一组皮下注射生理盐水，作为空白对照；一组皮下注射30 mg/kg阿司匹林(Aspirin)水溶液，作为对照组；其余6组编号为常春藤皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷a、b、c、d、e、f，分别皮下注射不同浓度的化合物3试液(给药量为100、50、30、10、3、1 mg/kg)，每只小鼠注射量为0.2 mL.

将注射药品后的小鼠尾巴置于(50±0.5)℃恒温水浴锅中，记录小鼠从尾巴放入水浴锅中到第一次甩尾所用的时间(T)，每隔15 min将小鼠尾巴放入水浴锅测一次，即测量小鼠给药0 min、15 min、30 min、45 min、60 min后的甩尾时间[7].将小鼠未给药前的甩尾时间设为T0，镇痛率公式如下

式中：P-痛阈提高率，T-给药后小鼠甩尾时间，T0-给药前小鼠甩尾时间.

再以常春藤皂苷元-3-O-β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-α-L-阿拉伯吡喃糖苷为测试液，重复上述实验.

1.2.5 抗炎活性测定

采用抑制二甲苯致小鼠耳肿胀法.雄性昆明小鼠36只，随机分为6组，每组6只.测试组分别为不同浓度的常春藤皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷、常春藤皂苷元-3-O-β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(给药量为1、3、10、30 mg/kg)；阿司匹林30 mg/kg剂量组为对照组；以生理盐水为空白组.

以上各组分别按0.2 mL/10 g皮下注射药物及对照液，每天一次，连续5天.末次给药后1 h，以30μl二甲苯涂予小鼠右耳两面致炎，左耳不涂，致炎后45 min处死小鼠.用直径9 mm的打孔器打下左右耳片，称重，以左右耳片重量差作为肿胀程度[8].数据进行组间t检验.取肿胀平均值计算抑制率，其公式如下.

抑制率Y(%)=(E0-Et)/E0×100%

其中：E0、Et分别代表空白组和给药组的平均肿胀度.

2 结果与讨论

2.1 化合物抑菌活性

从红毛七中分离纯化得到的常春藤皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(1)、常春藤皂苷元-3-O-β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(2)、16α-羟基-齐墩果-12-烯-28-酸-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(3)、葳严仙皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(4)、α-菠菜甾醇(5)等的MIC测试结果(见表1)可以看出，5个化合物对测试的8种菌均有一定的抑制作用.

表1为各样品对测试细菌的MIC，表2为各样品对植物病原真菌的MIC.从表中看出：化合物1-4抑制植物病原真菌的能力明显大于化合物5，说明具有齐墩果烷型的三萜皂苷比甾醇类化合物有更好的抑制真菌能力.化合物3和4抑菌活性大于化合物1和2；MIC数据显示，同等条件下与真菌相比，5个化合物对细菌有更为显著的抑制作用，其中化合物3和4具有广谱抑菌活性，可以作很好的抗菌剂使用.

表1 不同化合物对细菌最小抑菌浓度

表2 不同化合物对真菌最小抑菌浓度

2.2 化合物镇痛活性

通过热板法，按照章节1.2.4中所述，测试不同浓度常春藤皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(1)，常春藤皂苷元-3-O-β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(2)等对小鼠痛阈值提高率随时间的变化，研究化合物1、2的镇痛活性，实验结果见图1、2.

图1 不同剂量的化合物1对小鼠镇痛提高率随时间变化的趋势

图2 不同剂量的化合物2对小鼠镇痛提高率随时间变化的趋势

从图1、2看出，2种化合物对小鼠的镇痛提高率与剂量呈依赖性，在浓度为1～30 mg/kg范围内，镇痛效果随剂量的增大而增大；浓度为30～100 mg/kg范围内，镇痛效果随剂量的增大而减小；随时间的变化趋势是镇痛提高率先增大后减小，注射化合物30 min后达最大.

2种化合物等剂量时镇痛效果的比较，结果见图3.结果显示：等剂量的化合物1，2对小鼠的镇痛效果均大于对照组阿司匹林，化合物2更为显著，甚至浓度为10 mg/kg时镇痛效果比浓度为30 mg/kg阿司匹林还显著.从结构上来看，带有双糖的化合物2比带有单糖的化合物1镇痛效果更显著.

图3 等剂量的化合物1，2与阿司匹林对小鼠的镇痛提高率随时间的变化趋势

2.3 化合物抗炎活性

通过抑制二甲苯致小鼠耳肿胀法，按照章节1.2.5中所述，测试不同浓度常春藤皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(1)，常春藤皂苷元-3-O-β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(2)等致小鼠耳肿胀程度随时间的变化，通过抑制率研究化合物1、2抗炎活性，实验结果见表3.

表3 化合物1、2与阿司匹林致小鼠耳肿胀抑制率

从表3看出，化合物1、2均有抗炎作用，且抗炎效果与化合物的浓度成剂量依赖性，当浓度同为30 mg/kg时，2种化合物抑制率均大于阿司匹林，抗炎效果较为显著.从结构上看，化合物1、2母核结构相同，连接糖的个数不同，化合物1为单糖皂苷，化合物2为双糖皂苷，化合物1的抗炎效果大于化合物2.

3 结论

(1)红毛七中含有丰富的具有抑菌活性的物质.其中三萜皂苷类化合物对细菌具有更为显著的抑制作用.

(2)三萜皂苷类化合物对小鼠的镇痛提高率与剂量呈依赖性，同种剂量的化合物相比，含有双糖的化合物镇痛效果更好.

(3)从红毛七中分离得到三萜皂苷类化合物具有抗炎作用，抗炎效果与化合物的浓度成剂量依赖性.且含有单糖的化合物的抗炎效果大于含有双糖的化合物.推测抗炎效果与皂苷元上连接糖的个数有关.

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