E B V-DNA定量检测对鼻咽癌的诊断

李 哲 翁玉玲.广东省东莞市大朗医院输血科，广东东莞 53770；.广东省东莞市人民医院检验科，广东东莞 53000

E B V-DNA定量检测对鼻咽癌的诊断

李 哲1翁玉玲2
1.广东省东莞市大朗医院输血科，广东东莞 523770；2.广东省东莞市人民医院检验科，广东东莞 523000

目的通过对鼻咽癌患者经治疗后EBV-DNA含量变化的观察，为临床诊治该病寻求最佳方法。 方法 血浆EBV-DNA检测采用荧光定量PCR法，选择确诊的145例鼻咽癌患者为研究对象，对其EBV-DNA进行定量检测，并以同期健康者140名的血浆情况进行对比研究。 结果 鼻咽癌组中有136例（93.79%）患者血浆EBVDNA呈阳性；健康组中有10例（7.14%）血浆EBV-DNA呈阳性，鼻咽癌组患者血浆EBV-DNA阳性检出率明显高出健康组（P<0.01）；血浆EBV-DNA呈阳性的患者在治疗过程中，血浆EBV-DNA含量呈逐渐下降趋势。结论 给予鼻咽癌患者EBV-DNA定量检测，对诊断和指导治疗价值明显。

EBV-DN；定量检测；鼻咽癌；诊断

EB病毒（EBV）是一种普遍存在的疱疹病毒群，感染后能累及机体全身各个器官系统[1]。人体一旦被该病毒侵入，易引起癌变。鼻咽癌在我国的发病率较高，多发于我国南方[2]。该病属于恶性肿瘤的一种，目前虽未清楚其致病源，但自患者血浆中发现了EBV-DNA后，普遍存在观点认为该病的发病与EBV感染有关联。多位学者研究证实：对患者血浆中EBV-DNA含量的检测，可观察到机体内肿瘤负荷状况。本院将已被确诊的145例鼻咽癌患者为研究对象，并以同期身体健康者140名进行对比研究，旨在探讨EBV-DNA定量检测对鼻咽癌患者的临床作用，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

将2012年1月～2012年6月已被本院确诊的145例鼻咽癌患者（鼻咽癌组）为研究对象，其中，男85例，女60例，年龄2～76岁，平均45岁；其中泡状核癌、低分化鳞癌、中分化鳞癌例数分别为21、86、38例。同时选择身体健康者140名为健康组，进行对照研究。

1.2 方法

1.2.1 血浆EBV-DNA检测采用荧光定量PCR法[3]。标本采集手段：抽取研究对象外周血3mL，置入EDTA抗凝管内，给予每分钟4000r离心后实施上层血浆分离，将被分离出的50μL血浆存放在零下20℃的温度中；试剂盒选择德国Qiagen公司提供，对分离出的血浆按说明要求进行血浆DNA提取。荧光定量PCR扩增：扩增的目的基因为EBV的BamH1-W片段。上下游引物序列分别是W-44F和W-119R，给予每批PCR以双蒸水为阴性参照；克隆合成的EBV的DNAW片段为阳性参照，将其稀释为不同的浓度梯度后给予扩增，浓度梯度为：106、105、104、103、102、10copies/uL；PCR以50μL为反应总体积，其中含缓冲液10μL PCR，引物与相对的荧光标记探针各为10pmol。dATP、dCTP、dGTP、dUTP 均为 200μmol/L 5U Tap 聚合酶，5μL DNA模板，将提取的DNA置入PCR反应管中实施扩增。计算血浆EBV-DNA拷贝数，当结果低于1×103拷贝/mL视为阴性。

1.2.2 治疗方法 给予患者放疗结合化疗法。放疗：Siemens直线加速器6MV X线体外照射，照射范围包括鼻咽部肿瘤及颈部淋巴引流区，进行常规分割放疗，每天2Gy，1周5次，鼻咽部给予6mV X线照射，颈部 12MeV β线与9MeV β线照射。化疗：在进行放疗当天、第4周最后1d、第7周最后1d，均给予顺铂联合亚叶酸钙200mg/m2联合5-氟尿嘧啶500mg/m2化疗，共计4个疗程，3周为1个疗程；化疗同时应充分水化并联合止吐处理，并注意复查患者血常规、肝肾功能和心电图。

1.3 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件，计数资料用百分率表示，组间比较行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组人员血浆EBV-DNA阳性检出率

鼻咽癌组中有136例 （93.79%）患者血浆EBV-DNA呈阳性；健康组中有10例（7.14%）血浆EBV-DNA呈阳性，鼻咽癌组患者血浆EBV-DNA阳性检出率明显高出健康组（P<0.01），见表 1。

表1 两组血浆EBV-DNA阳性检出率对比表（n）

2.2 鼻咽癌组治疗后不同时期血浆EBV-DNA水平

对136例血浆EBV-DNA阳性患者治疗后：有125例患者经治疗后EBV-DNA含量逐渐下降，在42d后未能检测出含有EBV-DNA，其余11例仍含有EBV-DNA，情况见表2。

表2 136例血浆EBV-DNA阳性患者不同时期血浆EBV-DNA水平（IU/mL）

3 讨论

EBV特点为亲淋巴细胞性和亲上皮细胞性[4]。经临床资料显示EB病毒感染淋巴细胞是致鼻咽癌的主要因素，对该病的诊断，目前以影像学检查为主，但该检查存在费用高、对治疗效果的判定差、癌细胞转移敏感性不高等缺点，因此，在临床的采用上受到一定限制。该技术手段因属于局部显影技术，导致其不能对可能会发生癌细胞转移部位进行完全检测，同时对较小的转移处、残存肿瘤性质的判断等方面均被制约。伴随核酸分子杂交与PCR技术的进步，鼻咽癌诊断方式也随之更新，PCR技术因具有高特异、高灵敏和有效防污的优点在临床备受亲睐，当检测到患者体内EBV-DNA拷贝数高，说明其病症较重。本文对两组人员血浆EBV-DNA阳性检出率对比中发现：鼻咽癌组中有136例（93.79%）患者血浆EBV-DNA呈阳性；健康者组中有10例（7.14%）血浆EBV-DNA呈阳性，鼻咽癌组患者血浆EBV-DNA呈阳性检出率明显高出健康组 （P< 0.01）；鼻咽癌组患者在治疗过程中，血浆EBV-DNA含量呈逐渐下降趋势，由此可见：鼻咽癌的发生和EBV之间存在密切联系。

鼻咽癌是鼻咽上皮细胞发生的恶性肿瘤，在我国南方头颈部恶性肿瘤中发病率居前位[5]。该病的发病与EBV有关，EBV病毒归类为疱疹病毒科，EBV病毒一旦被感染，将在细胞核内转录 EBER，在其感染后生成的相关产物可引发细胞增殖和细胞凋亡的抑制及一系列基因变异而导致恶变。EB-DNA拷贝数，VCA-IgA抗体滴数以及EA-IgA抗体滴数可间接反映EB病毒在人体内的激活状态[6]。在本次研究中可以显示出：其检测值能间接体现出咽后淋巴结的转移状况。鼻咽癌的恶性程度高，有些患者在鼻咽镜检查尚未发现原发灶时，就有淋巴结转移[7]。在患者外周血中有多种EB病毒相关的抗原、抗体，早期以采用血浆VCAIgA当作对鼻咽癌治疗效果评判的血液学指标，但其不能及时反应肿瘤消长变化情况。检测血清中抗EB病毒抗体水平是临床上辅助诊断鼻咽癌的常规手段[8]，该手段取材方便且易于操作，具备敏感性高等优点，已广泛应用与鼻咽癌的筛查及鼻咽癌放疗后复发的监测。

总之，给予鼻咽癌患者EBV-DNA定量检测，对诊断和指导治疗价值明显，值得临床应用。

[1]柳文菊，杜昆.监测血浆EBV-DNA含量在鼻咽癌诊疗中的意义[J].海南医学，2012，23（18）：7-9.

[2]王雪英.定量检测血浆EBV-DNA在鼻咽癌诊治中的临床研究[J].当代医学，2012，18（12）：5-6.

[3]李杰.血浆EBV-DNA检测对鼻咽癌的诊断价值的探讨[J].医学检验与临床，2011，22（1）：20-22.

[4]孔平.鼻咽癌患者血浆与PBMC EBV-DNA定量测定的临床意义[J].山东医学高等专科学校学报，2010，32（5）：321-324.

[5]应香岚，杨幼萍，应亚君，等.EBV病毒PCNAKi-67和C-myc癌基因蛋白在鼻咽癌中的表达及预后意义[J].浙江临床医学，2011，13（11）：1201-1203.

[6]赵淑芬，朱超纲，陈新林，等.鼻咽癌咽后淋巴结转移与EBV-DNA血清学标记物关系探讨 [J].现代肿瘤医学，2012，20（10）：2034-2036.

[7]范国宇，刘伟.血浆EBV-DNA与VCA-IgA联合检测对鼻咽癌诊断的意义[J].中国实用医药，2012，7（19）：46-47.

[8]魏世鸿，罗宏涛，王小虎，等.血清EBV抗体检测联合99mTc-MIBI显像和MRI在诊断鼻咽癌放射治疗后复发中的价值[J].甘肃医药，2012，31（5）：327-330.

Quantitative detection of EBV-DNA for diagnosis of nasopharyngeal carcinoma

LI Zhe1WONG Yuling21.Department of Blood Transfusion,Dalang Hospital of Dongguan City in Guangdong Province,Dongguan 523700, China;2.Department of Clinical Laboratory,People's Hospital of Dongguan City in Guangdong Province,Dongguan 523000,China

ObjectiveTo seek the best approach of diagnosis and treatment for the disease through observing the changes of EBV-DNA content of nasopharyngeal carcinoma patients after treatment.MethodsThe plasma EBV-DNA was detected by fluorescence quantitative PCR method.One hundred and forty five patients confirmed as nasopharyngeal carcinoma were selected as study object.Their plasma EBV-DNA were detected and compared with those of 140healthy persons in corresponding time.ResultsIn the nasopharyngeal carcinoma group,136cases(93.79%)showed plasma EBV-DNA-positive,while 10cases(7.14%)in healthy group.The plasma EBV-DNA-positive detection rate of nasopharyngeal carcinoma group was significantly higher than that of healthy group(P＜0.01).In plasma EBV-DNA-positive patients,the plasma EBV-DNA content decreased gradually in the course of treatment.ConclusionThe quantitative detection of EBV-DNA for nasopharyngeal carcinoma patients has significant value in diagnosing and guiding treatment of the disease.

EBV-DN;Quantitative detection;Nasopharyngeal carcinoma;Diagnosis

R739.6

A

1674-4721（2013）05（b）-0106-02

2013-03-01 本文编辑：魏玉坡）