冬凌草甲素对膀胱癌T 24细胞增殖的抑制作用

赵 冬 刘红耀 赵 唤

1.山西医科大学，山西太原 030001；2.山西医学科学院（山西大医院）泌尿外科，山西太原 030001

冬凌草甲素对膀胱癌T 24细胞增殖的抑制作用

赵 冬1刘红耀2▲赵 唤1

1.山西医科大学，山西太原 030001；2.山西医学科学院（山西大医院）泌尿外科，山西太原 030001

目的探讨不同浓度的冬凌草甲素（ORI）在不同时间点对膀胱癌T24细胞增殖的抑制作用，为临床决策提供参考依据。 方法 将冬凌草甲素作用于T24细胞，利用酶标仪在不同时间点（λ=570nm）测定不同浓度的冬凌草甲素吸光度，同样方式用MTT法检测细胞的抑制率，流式细胞仪测定细胞凋亡率，其数值均以均数±标准差表示，每组结果由两位研究者重复测量2次校对。 结果 随着培养时间的延长及浓度的增加，T24细胞的吸光度数值呈明显下降趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）。浓度为8μmol/L时抑制率递增，16μmol/L时抑制率已接近50%，而32μmol/L时抑制率最高可达70%以上，变化显著，差异有统计学意义（P＜0.05）。随时间、浓度梯度的变化，T24细胞凋亡率不断增加，最高可达60%以上，差异有统计学意义（P＜0.05）。证明冬凌草甲素对膀胱癌T24细胞增殖的抑制具有明显的浓度-效应与时间-效应的关系。结论 冬凌草甲素可诱导膀胱癌T24细胞凋亡，有明显的抗肿瘤作用。

冬凌草甲素；T24细胞；吸光度；抑制；凋亡

冬凌草又称为冰凌草、雪花草，因形似蝶状冰凌片而得名，在冬凌草植被中提炼出的一种二萜类抗肿瘤天然有机化合物成分为冬凌草甲素（ORI）。近年来有大量文献曾研究冬凌草具有抗肿瘤作用[1-2]，常用于食管癌、胃癌的治疗，其无明显毒副作用，效果较好[3]。临床研究中曾报道，冬凌草有明显的抑制膀胱肿瘤的作用[4]，车宪平等[5]也曾研究过预防小鼠膀胱癌的复发，具体作用机制尚不明确。基于此，本次实验试探讨ORI对膀胱癌T24细胞增殖的抑制作用及机制。

1 资料与方法

1.1 细胞及试剂

冬凌草甲素 （上海双博生物科技有限公司111721-200602），二甲基亚砜（DMSO， BIOSHARP 公司 0231），T24细胞（上海瑞齐生物科技有限公司RS20230），1640培养液（北京赛默飞世尔生物公司SH30809），小牛血清（杭州四季青公司121005），磷酸盐缓冲液（PBS，solarbio公司P1022-500），四甲基噻唑蓝（MTT，sigma M-2122），Avnnexin V-FITC试剂盒（碧云天生物科技有限公司C1062），Hoechst 33258（Sigma公司 20051201）。

1.2 仪器及设备

超净工作台（苏净集团安泰公司），二氧化碳细胞培养箱（上海力申科学仪器有限公司），酶标仪（美国贝克曼公司），电子、倒置显微镜（奥林巴斯电子公司），流式细胞仪及配套鞘液 （美国贝克曼公司），离心机 （德国RUMAZENTRIFUGEN），-80℃冰箱及 4℃冰箱 （日本 SANYO公司），96孔培养板（上海乔跃电子有限公司），电热恒温水浴箱（上海博迅实业有限公司）。

1.3 操作方法

细胞培养：将T24细胞放置于含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，37℃二氧化碳培养箱里培养，每1天换液1次，收集对数生长期的细胞进行实验。

细胞吸光度的测定：2.5mmol/LDMSO加入含有冬凌草甲素的培养瓶中，分别添加 10μL、20μL、40μL，将其冬凌草甲素的浓度调制为 8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L；以相同浓度的PBS溶液加入到培养瓶中作为对照组，用酶标仪（λ=570nm为测试波长，λ=630nm为参考波长）读取吸光度A值。

细胞抑制率的测定：取对数增长期的T24细胞，调整细胞浓度为2×105/mL，接种于96孔板上，每孔加入细胞悬液100μL，培养 10h 后分别加入 8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L浓度的冬凌草甲素，以加入相同浓度的PBS溶液作为对照，培养48h后，分别加入5g/LMTT溶液20μL，再培养4h后取出，离心去上清液，再分别加入PBS溶液150μL振荡摇匀，显微镜下观察其着色粒消失后以λ=570nm测试波长，λ=630nm为参考波长读取吸光度A值，并通过吸光度值计算细胞抑制率（Apbs-Aori）/Apbs，其中Apbs为磷酸盐缓冲液的吸光度值，Aori为冬凌草甲素的吸光度值。

细胞凋亡率的测定：根据Avnnexin V-FITC试剂盒说明操作， 将三个浓度为 8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L 的冬凌草甲素分别加入到不同时间点的T24培养瓶里（悬浮在500μL 缓冲液中），并各自加入 5uL Avnnexin V-FITC，避光放置5min后，行流式细胞仪检测。凋亡率=凋亡细胞数/（凋亡细胞数+正常细胞数）。

上述浓度的培养瓶分别在37℃二氧化碳培养箱中存放，12h、24h、48h后进行数据测定，并由两位研究者重复测量2次校对。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件分析。数据以表示，组间比较拟用单因素方差分析（ANOVA），组内比较以配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 冬凌草甲素对膀胱癌T24细胞吸光度的变化分析

随着时间及ORI浓度的增长，各梯度的膀胱癌T24细胞吸光度值明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），即活性细胞逐渐减少，吸光度值与其时间及浓度梯度呈负相关，提示ORI对膀胱癌移行细胞癌细胞有抑制作用，并与其时间及浓度梯度呈正相关。（PBS对照组各梯度膀胱癌T24细胞吸光度值变化不明显，差异无统计学意义，P＞0.05）。见表1。

表1 ORI对膀胱癌T24细胞吸光度变化（n=20）

2.2 冬凌草甲素对膀胱癌T24细胞增殖的抑制分析

随着时间梯度抑制率组内比较分析可见：3个时间点的数值两者比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。组间比较分析可见：3个浓度的数值随不同时间两者比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（PBS对照组各梯度膀胱癌T24细胞抑制率无明显变化，差异无统计学意义，P＞0.05），见表2。

2.3 冬凌草甲素诱导膀胱癌T24细胞凋亡率分析

3个浓度的细胞凋亡率随不同时间比较结果见表3。3个时间点的数值两者比较，差异均有统计学意义 （P＜0.05）。组间比较分析可见：3个浓度的数值随不同时间两者比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（PBS对照组各梯度膀胱癌T24细胞凋亡率变化不显著，差异无统计学意义，P ＞ 0.05）。

表2 ORI对膀胱癌T24细胞增殖的抑制率（%，±s，n=20）

表2 ORI对膀胱癌T24细胞增殖的抑制率（%，±s，n=20）

时间梯度 8μmol/L 16μmol/L 32μmol/L 12h 24h 48h 11.31±0.9214.26±1.1816.01±0.9514.27±0.3121.53±1.9847.42±2.0522.74±1.8749.86±2.9172.55±2.27

表 3 ORI诱导膀胱癌 T24细胞凋亡率（%，±s，n=20）

表 3 ORI诱导膀胱癌 T24细胞凋亡率（%，±s，n=20）

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3 讨论

冬凌草甲素具有抗肿瘤作用，其机制尚未明确，作用机制可能阻滞了细胞的生长，延缓了细胞周期并诱导其凋亡[6-8]，细胞凋亡是细胞的一种生物学现象，由基因控制其主动死亡[9]。本次实验研究结果显示：T24细胞吸光度值的降低，是冬凌草甲素抑制了细胞的活性所致，吸光度值与其时间、浓度梯度呈负相关，提示ORI对T24细胞有抑制作用，并与其时间及浓度梯度呈正相关。冬凌草甲素可能通过多种途径来杀伤肿瘤细胞，抑制细胞增殖，限制肿瘤细胞钠泵活性，影响细胞生长，因肿瘤的增长需摄入大量营养物质，并靠钠泵来维持循环[10]，此实验表明，冬凌草甲素对膀胱癌T24细胞活性的抑制具有明显的浓度-效应与时间-效应的关系。从生物膜转运的途径可以证实冬凌草甲素具有抗肿瘤的作用。

冬凌草甲素对膀胱癌T24细胞的抑制分析中可见随时间及浓度梯度的增加，抑制率升高，冬凌草甲素抑制癌细胞增殖效果明显。其机制可能与冬凌草甲素抑制癌细胞DNA、RNA及蛋白合成有关，王绵英等[11-12]研究了冬凌草甲素对DNA、RNA、蛋白质合成的影响，结果为冬凌草甲素可迅速抑制其肿瘤DNA的形成；U细胞试验中随时间的延长，细胞明显增多，标记细胞的颗粒计数明显减少，两个试验均验证了冬凌草甲素参与了DNA合成的抑制过程。

冬凌草甲素诱导膀胱癌T24细胞凋亡率分析中已明确了随时间及浓度梯度的增长，凋亡率数值呈大幅度上升趋势。诱导细胞凋亡是一种特殊的细胞死亡方式，其作用机制可能为一定浓度的冬凌草甲素作用于肿瘤细胞后，细胞相互分散，贴壁生长的细胞减少，细胞体积减小萎缩，细胞核固缩，凋亡小体出现[13-14]。

综上所述，此次实验再次证明冬凌草甲素具有明显的抗肿瘤作用，可抑制膀胱癌T24细胞的增殖，诱导其凋亡，冬凌草甲素是一种活性较好的抗肿瘤中药制剂，具有较好的临床应用价值，虽抗肿瘤的作用机制需进一步深入研究，但能为改善膀胱癌术后复发率开辟新的治疗途径。

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Inhibiting effect of Oridonin on proliferation of bladder cancer T24cells

ZHAO Dong1LIU Hongyao2▲ ZHAO Huan11.Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2.Department of Urology,Shanxi Academy of Medical Science(Shanxi Hospital),Taiyuan 030001,China

ObjectiveTo investigate the inhibiting effect of Oridonin,in different concentrations and at different time points,on the proliferation of bladder cancer T24cells,and provide reference for clinical decision making.MethodsThe T24cells were affected by Oridonin.At different time points(λ=570nm)and in different Oridonin concentrations, the Oridonin absorbance was determined by microplate reader,the inhibition rate by MTT method,and cell apoptosis rate by flow cytometry.The results of determination were expressed as mean±standard deviation.The determination of each set of results were repeated and proofreaded by two researchers.ResultsAs the incubation time prolonged and concentration increased,T24cells absorbance values were showed a downward trend with statistically significant difference (P ＜ 0.05).The inhibition rate was steadily increased when the Oridonin concentration was 8μmol/L,near 50%when 16μmol/L,and up to more than 70%when 32μmol/L with statistically significant difference (P ＜ 0.05). As the change of time and concentration gradient,the apoptosis rate of T24cells was an escalation and up to more than 60%with statistically significant difference(P＜0.05).It was proved that the proliferation inhibition of Oridonin to bladder cancer T24cells has significant relationship of concentration-effect and time-effect.ConclusionOridonin can induce apoptosis of bladder cancer T24cells and has significant anti-tumor effect.

Oridonin;T24cells;Absorbance;Inhibition;Apoptosis

R737

A

1674-4721（2013）05（b）-0004-03

赵冬（1981-），性别：男；学历：硕士；籍贯：山西太原；山西医科大学研究生学院，研究方向：泌尿系肿瘤。

▲通讯作者：刘红耀（1965-），性别：男；籍贯：山西太原；学历：博士；职称：教授，山西医学科学院（山西大医院）泌尿外科，研究方向：主要从事泌尿系肿瘤方向的研究。

2013-02-05 本文编辑：魏玉坡）