6-羟基多巴胺诱导帕金森病动物模型及其研究进展①

杨谦谦，孙芳玲，艾厚喜，张丽，蒋莹，王文

6-羟基多巴胺诱导帕金森病动物模型及其研究进展①

杨谦谦1,2，孙芳玲1，艾厚喜1，张丽1，蒋莹1，王文1

帕金森病是中老年人常见的神经变性疾病。6-羟基多巴胺诱导类帕金森病的模型对研究帕金森病主要病理机制和治疗药物起重要作用。

帕金森病；动物模型；病理机制；药物治疗；综述

[本文著录格式]杨谦谦，孙芳玲，艾厚喜，等.6-羟基多巴胺诱导帕金森病动物模型及其研究进展[J].中国康复理论与实践, 2013,19(11):1006-1009.

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种常见的神经系统退行性疾病，其主要病理改变是黑质致密部多巴胺神经元的大量丢失，临床表现为静止性震颤、肌张力增高、运动迟缓或减少、姿势异常等。帕金森病严重影响患者的运动和生活能力，是一种致残率高、病期长、给患者及其家庭和社会带来沉重负担的疾病。

几十年来，对帕金森病的研究越来越受到关注。无论研究其发病机制，还是探索新的治疗方法都离不开帕金森病实验模型。目前建立帕金森病动物模型的方法主要有两种：①将6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)注入脑内黑质纹状体系统或内侧前脑束，损毁多巴胺能神经元，以制作大鼠、几内亚猪、猫、猴、鸟类等动物帕金森病模型[1-2]；②用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl 4-phenyl 1,2,3,6-tetrahydropyrid ine,MPTP)诱发灵长类动物(猴)和小鼠的帕金森病模型。尽管MPTP诱发猴的运动障碍与人相似，但局部解剖显示，损伤与帕金森病患者不完全一样，且MPTP损伤后有时可自发恢复。6-OHDA诱发的帕金森病模型动物来源广泛(以大鼠最常用)，制作成本较低，行为学变化易于观察且持续时间长，故目前在帕金森病的研究中应用最广。其他如鱼藤酮[3]，为容易透过血脑屏障的天然有机杀虫剂，它对脑组织线粒体呼吸链复合体Ⅰ的活性具有强大而广泛的抑制作用，选择性引起黑质-纹状体多巴胺(dopamine,DA)系统变性。

1 6-OHDA模型及其评估

1.1 6-OHDA模型

6-OHDA是神经递质多巴胺的羟基化衍生物，于1959年首先被Senoh等成功分离，能高选择地引起交感神经肾上腺素能神经末梢急性溃变。1968年，Ungerstedt的研究显示，向黑质致密部注射6-OHDA能导致黑质纹状体多巴胺系统顺行性变性，从而生成第一个动物模型的制备[4]。

6-OHDA不能通过血脑屏障，需立体定向注入脑内。经典的方法是向黑质致密部、黑质纹状体或内侧前脑束注射，能够产生巨大甚至完全的黑质多巴胺细胞体损伤。当6-OHDA注射至大鼠纹状体后，可被多巴胺神经元末梢通过轴突逆转运至黑质内的细胞体内；注射至大鼠黑质内时，6-OHDA与多巴胺竞争摄取位点，被摄取到细胞中。胞体的膜转运体转运6-OHDA到细胞内，经氧化生成神经毒物质，如羟自由基和醌类，破坏多巴胺神经元的抗氧化系统，线粒体功能损伤，膜稳定性和DNA完整性破坏，细胞变性、死亡，黑质-纹状体多巴胺系统功能减退，产生类似帕金森病的症状。

由于双侧注入6-OHDA后，往往因为吞咽障碍(aphagia)、渴感缺乏(adipsia)及运动不能(akinesia)等而使动物的死亡率极高[5]，所以6-OHDA对脑黑质-纹状体系统的损毁通常为单侧；单侧注射内侧前脑束能够产生显著地肌肉震颤行为[6-7]。使用不同剂量、不同浓度6-OHDA，损毁不同位点所制作的帕金森病大鼠模型不同。如第8周大剂量组(16 μg)比中剂量组(8 μg)和小剂量组(4 μg)在行为学上变化更明显。当细胞丢失达70%时，帕金森病症状会更明显；然而丢失40%时，能够被观察到一些重要的变化。增加注射剂量可以产生持续扩大的细胞丢失和行为学变化[8]。

1.2 评估

模型是否制作成功可用阿朴吗啡旋转测试。阿朴吗啡是一种突触后多巴胺受体激动剂；由于损毁侧纹状体内多巴胺受体密度上调，敏感性增强，出现去神经超敏感现象，故给药后使损毁侧多巴胺活动增强，导致帕金森病模型大鼠向损伤对侧旋转。通常给予0.2～0.5mg/kg阿朴吗啡即可出现向对侧旋转的行为，共记录30 min，若旋转圈数＞7 r/min或＞210 r/30 min，则视为造模成功。

2 主要病理变化

帕金森病的神经退行性活动涉及的毒理机制有氧化应激、线粒体功能障碍、细胞凋亡、炎症和影响神经元数量及放电等方面。

2.1 氧化应激反应

6-OHDA引起神经损伤的主要原因是毒素引起的大规模氧化应激。氧化应激能够广泛破坏脂质、蛋白质和DNA，导致多种机制的细胞死亡，包括不同的凋亡细胞信号分子的激活[9]。在生物体内，脑组织更易受氧化应激的损伤，因为大脑有大量、高浓度不饱和脂肪酸(脂质过氧化反应的底物)，又需要较多氧供，且自由基清除机制相对缺乏。通常，未经调节的活性氧使钙的调节异常，细胞损伤和线粒体功能障碍，最终导致凋亡级联酶激活，促进核转录因子-κB(NF-κB)激活并介导炎症过程。

6-OHDA具有高亲和力，通过和多巴胺竞争多巴胺转运体而进入黑质-纹状体多巴胺能神经元，在胞质内积聚并促使自动氧化，产生大量自由基，如H2O2、超氧化物和相应的醌。生成的大量活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)超出了多巴胺能神经元自身抗氧化清除能力，表现出神经毒作用。H2O2在Fe2+存在下发生Fenton反应，生成羟自由基(-OH)，攻击细胞膜上不饱和脂肪酸，造成脂质过氧化，从而损伤细胞。

2.2 线粒体损伤

线粒体功能障碍通过生成活性氧，也参与了氧化损伤和在细胞信号通路中导致细胞死亡。帕金森病药物体外研究显示，6-OHDA通过诱导线粒体破碎来破坏线粒体动力学。这时可通过对动力相关蛋白1(dynamin related protein 1,DRP1)从胞质迁移到线粒体来监测线粒体裂变的激活[10]。

因为神经元细胞的代谢需要高能量，故更加依赖线粒体供能，线粒体损伤是神经退行性疾病的一大病因。有人报道，6-OHDA能直接抑制线粒体呼吸酶复合体Ⅰ(NADH脱氢酶)和复合体Ⅳ(细胞色素氧化酶)活性，从而抑制线粒体呼吸链的功能，导致细胞内ATP耗竭，引起细胞死亡。另外，由于氧化应激中NADH的消耗，致使发生在线粒体上的电子转移受限，也可导致ATP合成减少。

2.3 诱发细胞凋亡

6-OHDA是神经毒素，通常诱导多巴胺通路损伤。研究发现，它通过抑制线粒体复合酶Ⅰ、释放细胞色素C和凋亡诱导因子(AIF)、激活caspases-9和caspases-3、激酶信号调节机制、NF-κB介导的炎性反应来诱导细胞凋亡[9]。用6-OHDA诱导帕金森病模型鼠中脑黑质神经细胞凋亡，透射电镜下可见模型组中脑黑质致密部部分细胞出现染色质致密或凝固成边界清晰的块状物，有些出现核膜破裂，形成多个凋亡小体；对照组未见有此典型的凋亡形态学改变。最近研究显示，6-OHDA可引起一氧化氮(NO)含量增加，在体外诱导pc12细胞凋亡；也可以通过细胞周期依赖性蛋白激酶5(cell cycle dependent protein kinase 5,CDK-5)介导的肌细胞增强因子2(myocyte enhancer factor 2,MEF2)的高度磷酸化，引起MEF2D显著下调，从而使pc12细胞死亡。这表明，由6-OHDA造成的细胞死亡和MEF2D下降依赖于CDK-5的活性。这种现象可以由CDK-5抑制剂加以保护，但6-OHDA产生的蛋白酶失活却不能缓解[11]。

2.4 介导炎性反应

6-OHDA注入黑质纹状体内出现的损伤与炎性反应有关，这在帕金森病的其他毒性模型(MPTP和鱼藤酮)中也能观察到，主要表现为小胶质细胞激活、巨噬细胞数量增加，它们在免疫监视和即时免疫反应中扮演着重要角色。

激活的小胶质细胞释放多种细胞因子，如白细胞介素-1β (interleukin 1β,IL-1β)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)等，细胞因子水平在局部持续增高可诱导炎性反应，对多巴胺能神经元产生毒性作用，导致帕金森病。脂多糖/IFN-γ不仅可通过干扰素调节因子-1诱导小胶质细胞产生一氧化氮；还可诱导caspase-11表达，启动小胶质细胞不依赖于一氧化氮的细胞凋亡。干扰素调节因子-1和caspase-11是小胶质细胞诱导细胞死亡的必需物质。因此，脂多糖/干扰素-γ激活小胶质细胞可对多巴胺能神经元产生毒性作用。

2.5 丘脑底核神经元放电和代谢活性的变化

除了黑质致密部病变，6-OHDA也对其他基底神经核的代谢活动产生影响。大量研究证实，纹状体多巴胺去神经在基底神经节电路中能够触发一连串功能性改变，这最终导致丘脑底核(STN)功能的过度兴奋。

在啮齿类动物纹状体内注射6-OHDA后，可观察到一种细胞色素酶活性在脑半球的不对称，它是一种线粒体酶，用于标记所有基底神经节核中神经元的代谢活性[12]。向黑质致密部微量注射6-OHDA制作选择性损毁多巴胺神经元大鼠模型，结果显示丘脑底核神经元放电频率加快，且在损毁后的第6、8周显著，呈爆发性放电的细胞数也较对照组明显增多[13]。向大鼠内侧前脑束(MFB)定量注射6-OHDA后，可观察到苍白球(GP)神经元内阳性小清蛋白(PV)的大量丢失，继而活性减退，造成丘脑底核区过度活跃，从而引起运动不能[14]。也有研究显示，大鼠纹状体背侧单侧定量注射6-OHDA后28 d，脑免疫组化显示，纹状体背侧和中央区的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxy-lase,TH)阳性纤维密度减少41%，而腹侧被盖区无影响；逆行到黑质神经元(SN)，最严重的损伤发生在腹侧区(55%)[15]。苍白球背侧和皮层扣带区损伤明显，产生严重的多巴胺能神经轴突损伤，这可能是造成帕金森后遗症的原因之一。

2.6 细胞内Ca2+超载

由于线粒体呼吸抑制可造成多巴胺能神经元能量供应障碍，导致线粒体Ca2+转运系统功能下降，胞浆内Ca2+浓度上升，激活磷酸酶和蛋白酶等降解酶，使细胞膜和细胞骨架降解，从而损害细胞功能并间接损伤细胞。另外，谷氨酸受体在异常情况下被过度刺激，也可造成胞外Ca2+过度内流，导致细胞内Ca2+超载。Ca2+浓度升高造成一些钙依赖性酶活性增加，包括一氧化氮合酶(NOS)，致使细胞内一氧化氮含量增加，而一氧化氮又可与超氧阴离子(O2-)结合形成过氧化亚硝酸离子(ONOO-)，造成多巴胺能神经元损害；另一方面，O2-可在Cu、Fe离子存在的情况下，转化为H2O2，并进一步形成-OH，最终也造成对多巴胺能神经元的损害。

3 新药开发中的应用

3.1 抗氧化应激

最近研究发现，防止多巴胺神经元氧化应激的一个策略是使用植物化学物作为诱导剂，产生内源性抗氧化剂和第二期的酶。异硫氰酸酯(ER)是一种十字花科类提取的化合物，能够使总谷胱甘肽(GSH)含量增多，总抗氧能力增强，增大细胞内神经元抗死亡能力，减少细胞凋亡[16]。α-硫辛酸(LA)是一种强抗氧化剂，发现于线粒体，参与其代谢，具有神经保护和抗凋亡作用，能显著改善6-OHDA造成的对侧旋转行为，是治疗由6-OHDA造成的线粒体功能障碍和氧化应激的潜在药物[17]。已证实其对由鱼藤酮造成的帕金森病模型有神经保护和抗凋亡作用。向内侧前脑束内注射6-OHDA造成黑质多巴胺系统完全损毁，口服没食子酸(GA)能显著改善6-OHDA造成的被动回避记忆降低，总硫醇和谷胱甘肽过氧化物酶抗氧化剂的含量也有所增加，并降低了丙二醛在海马和纹状体的含量[18]。

3.2 抗线粒体损伤

目前正在研究针对线粒体的抗氧化剂，如MitoQ、半胱氨酸[19]，防治线粒体氧化性损伤和改变活性氧在信号通路中的参与。证据显示，小分子抑制剂在治疗帕金森病线粒体裂变的潜力，可减少线粒体裂变和自噬细胞的数量[20]。有文献报道，雷帕霉素，一种抗生素，在减少氧化应激和保护线粒体方面起着关键作用。虽然其机制尚未明确，但用于动物模型的结果显示，它能够防止多巴胺能神经元损失，减轻线粒体超微结构损伤，使过氧化氢水平降低，抗氧化活性增高[21]。

3.3 抗细胞凋亡

体外研究显示，姜黄素Ⅰ，一种从姜黄中提取的纯化合物，能够阻止6-OHDA对多巴胺神经元产生的毒性，减少活性氧的生成，显著降低P53的磷酸化水平，减少细胞凋亡，具有神经保护活性[22]。由6-OHDA造成的细胞死亡和MEF2D下降依赖于CDK-5的活性，所以可以用CDK-5抑制剂对多巴胺神经元加以保护[11]。证据显示，食用抗氧化食物，如螺旋藻中提取的有效成分，也能有效减少自由基产生，抑制脂质过氧化和调节抗氧化酶系统，防止细胞凋亡[23]。橄榄叶提取物(OLE)和橄榄苦苷对6-OHDA诱导pc12细胞的凋亡有抗氧化保护作用，已被世界范围内的人们作为饮料添加剂使用，以期改善患者的健康[24]。

3.4 抗炎性反应

主要是从抑制炎性因子的生成和神经保护方面着手。目前研究的关于炎性介质的神经保护药物，如罗格列酮，能够明显阻止TH蛋白表达的降低，抑制小胶质细胞激活，减少环氧合酶-2(COX-2)和TNF-α的合成[25]，有效减少多巴胺损耗。普罗布考，一种低脂酚类化合物，具有降脂、抗炎和抗氧化活性，最近报道在神经毒性和神经退行性模型中被用作保护剂[26]。

4 展望

6-OHDA帕金森病大鼠模型为探讨帕金森病的发病机制及药物疗效判定、细胞移植治疗、基因治疗、神经保护治疗方面的研究提供了必要的实验基础，在病理、行为学等方面的表现与人类有不少相似之处。但此模型仍属急性损伤模型，也没有细胞内Lewy小体的表现，这与人类帕金森病有一定差异。故不太符合患者自然病程较长、病情进展缓慢、黑质多巴胺进行性退变的特点。因此如何从分子、细胞、整体三方面实现机能与形态研究的相互对应，找到动物、药物、剂量、靶位、方法等多因素作用的完美结合，全面地反映帕金森病病因、病机、病理、病程等特点；如何利用现代影像学技术、信息化处理手段来全程记录和定量分析去除人为因素的干扰，将是帕金森病动物模型进一步探讨的问题。

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Model of Parkinson's Disease Induced with 6-hydroxydopamine:Modeling and Pathology(review)

YANG Qian-qian,SUN Fang-ling,AI Hou-xi,et al.Department of Pharmacology,Xuanwu Hospital of Capital Medical University,Beijing 100053,China

Parkinson's disease is a common progressive neurodegenerative disorder among old people.Parkinson's disease model induced with 6-hydroxydopamine has been used to research pathology and medication of Parkinson's disease.

Parkinson's disease;animal model;pathology;medication;review

R742.5

A

1006-9771(2013)11-1006-04

2013-03-14

2013-04-16)

1.“重大新药创制”科技重大专项(No.2012ZX09102-201-016)；2.国家自然科学基金(No.81173575)；3.北京市自然科学基金(No.7062031)；4.北京市教委科技创新平台项目(No.111219)；5.2011年北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养计划项目(No.2011-3-097)；6.中国博士后基金(No.106455)。

1.首都医科大学宣武医院药物研究室，北京市100053；2.河北北方学院，河北张家口市075000。作者简介：杨谦谦(1988-)，女，汉族，河北邢台市人，硕士研究生，主要研究方向：神经药理。通讯作者：王文。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.11.002