人椎间盘髓核组织工程研究进展

张子言 佟 珅 颜华东 姜 睿 武 汉 (吉林大学中日联谊医院，吉林 长春 130033)

腰痛是老年人群中的常见病和多发病，构成了一个可观的流行病学和经济学问题。尽管目前医学的诊断及治疗技术不断进步，但随老年人逐渐增多，发病率表现为上升趋势〔1〕。腰痛造成极大的经济负担，在英国每年导致花费120亿英镑〔2〕，美国为1 000亿美元〔3〕。尽管引起腰痛的原因有许多，但是一个很明显的原因是与椎间盘(IVD)的退变密切相关。组织工程提供了将已退变的椎间盘恢复正常功能的方法，具有光明的前景。大多数研究直接指向了髓核(NP)组织工程，因为间盘退变被认为起源于NP区域，在过去10年中，对于这个问题已取得了相当大的进展。

1 IVD的生物学

IVD的解剖包括3个部分:纤维环(AF)，NP和终板(EP)。AF、NP三明治一样位于两块软骨终板之间，使相邻椎体成为一个整体〔4，5〕。外侧AF承受张力(圆周的，轴向的和旋转的)，NP承受压缩力，内侧AF则受二者的混合作用〔4，5〕。这些结构组合起来能够承受比单一组织更大的负荷，体现了保持完整复合结构的重要性。软骨终板在维持NP细胞活性上起关键作用〔6，7〕，它可防止NP突出至相邻椎体。因此这三种组织结构对保持IVD的正常功能是十分重要的。

2 IVD的退变

IVD退变常开始于人一生中的第二个十年，随年龄增长而发展，缺乏营养供应和不适当的机械负荷都可导致IVD细胞生存能力和IVD功能丢失或改变。NP基质的破坏源自合成和退变之间的不平衡，导致NP区域与水结合能力降低。在病理学中，退变的NP基质不再能够有效的承受负荷，其结果是发生IVD退变。同时，AF良好的薄片结构开始退化，最后发展到从内侧延伸到外围的撕裂。

3 IVD退变的治疗

目前IVD退变的治疗包括非手术治疗和手术治疗。非手术治疗包括生活方式改变(例如:降低体重，戒烟)，物理康复治疗(例如:锻炼，热/冷刺激，电刺激，针灸和牵引)以及使用止痛药物。当非手术方法不能缓解疼痛时，融合术仍旧是外科的标准疗法〔8〕。这种治疗具有巨大创伤，目的在于消除关节位置的活动，从而阻止疼痛。尽管临床上经常应用这种疗法，但是融合术常常达不到缓解疼痛的目的，还可能加速邻近IVD的退变性改变 。全间盘人工置换术是近来应用的一种外科治疗方式，目的在于维持节段的活动性。但是，它的远期效果尚未得到证实，人工IVD结构的磨损对于该治疗的远期效果来说具有挑战性和风险性〔10〕，考虑到人工IVD移植手术有大量的临床禁忌证以及有可能造成灾难性的并发症，这一方式有效性的证实仍需长期随访得来的数据的支持。

4 组织工程和IVD

组织工程中3种主要的组分，包括细胞，信号和支架。信号包括生物力学因素(机械负荷)和生物化学因子(细胞活素，酶，酶抑制剂和生长因子等)，其中生长因子已得到广泛研究〔11〕。

4.1 细胞因子 应用细胞因子促进IVD组织细胞功能活性的再生已成为目前骨科领域研究的热点，一些体内研究也证明该观点的有效性。

目前研究最多的与IVD退变相关的细胞因子有转化生长因子-β(TGF-β)〔12，13〕，胰岛素样生长因子 1(IGF-1)〔14〕，血小板生长因子(PDGF)〔14〕，成骨蛋白-1/骨形态蛋白-7(OP-1/BMP-7)〔13，15〕，BMP-2 和 BMP-12〔16，17〕，以及近几年成为研究热点的GDF-5〔18～20〕。

GDF-5〔21〕被认为是软骨形态蛋白-1(CDMP-1)和 BMP-14，是GDF家族的一员，与骨形态蛋白紧密相关。GDF-5主要的作用是刺激基质产生和IVD细胞的增殖。Walsh等〔22〕使用静态压力诱导了鼠尾间盘的退变，随后研究了体内不同生长因子的治疗作用。单独注射GDF-5明显刺激了IVD高度的增加，但是IGF-1、TGF-β 或 bFGF 没有这种效应。Masuda等〔15〕发现 rhGDF-5在牛的NP和AF细胞中，能够增加细胞的繁殖和基质的合成，NP细胞比AF细胞的应答效应更加明显。他们还报道了在兔间盘退变模型中，向NP区域注射rhGDF-5诱导了间盘高度的恢复和改善，并由组织学和MRI分析所证实。最新的证据显示〔18〕，GDF-5疗法能够改进NP细胞的成软骨细胞特征。

参与分解代谢的细胞因子有 IL-1、神经生长因子(NGF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)以及金属基质蛋白酶(MMPs)等，可促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖的降解。无论是体外细胞培养还是体内动物实验，都发现 MMPs(MMP-1，3，9，10)普遍存在于退变的IVD中，并且含量较高，提示其参与细胞外基质(ECM)的降解〔23，24〕。

4.2 细胞 NP细胞主要为脊索残留细胞，随着个体的发育成熟而逐渐消失，最终被软骨样细胞所替代。在动物模型中IVD的退行性变均在脊索源性细胞消失后才出现，尽管人类发育高峰期稍推后，但脊索源性细胞的消失和IVD退行性变间确实存在着某种密切关联，有待进一步的研究〔25〕。理论上，延缓NP退变需要移植同源自体NP细胞，但是很难想象能够从需要替代的退变组织中获取健康细胞。同样，从技术上和伦理学角度上获取健康人类的NP细胞是困难的，因为大多数IVD手术中切除的是已退变的NP。近来，永生化的人类NP细胞系已被研究出来，考虑可用于临床应用〔26〕。为了修复退变NP组织的基质，移植的细胞必须产生大量的蛋白聚糖(例如聚集蛋白多糖)，胶原蛋白和其他基质蛋白。软骨细胞和来自IVD中央区域的细胞通常产生这些基质蛋白，这使得他们可作为IVD修复的候选细胞。目前可供选择的种子细胞包括捐献的异体间盘细胞、自体软骨细胞和干细胞。间充质干细胞(MSC)同样被认为是一种活跃的，对 NP 退变的潜在的治疗选择〔14，27～30〕。而且，过去10年中对干细胞研究的进展，显示将成人MSCs用于NP 组织工程是很有前景的〔11，21，31～35〕。MSCs 的最初研究由Friedenstein和他的同事完成，已超过了40年。目前已被广泛认可，MSCs有分化为不同间叶起源细胞系的能力，包括软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞系，分化结果取决于不同的生物学环境，能够获得多种成人组织，例如骨髓、骨小梁、关节软骨、肌肉和脂肪。

脂肪干细胞(ADSC)在骨和软骨修复中作为一种细胞资源已得到密切关注〔13〕。尤其，在最近的研究中，在NP组织退变中应用 ADSCs，研究结果令人备受鼓舞〔20，36〕。Lu 等〔37〕报道了将人类ADSCs和NP细胞以微块方式共培养，导致ADSCs向类NP细胞表现型方向分化。Tapp等〔20〕透露在三维培养的沙鼠ADSCs用TGF-b处理或与人类IVD细胞共培养都可以明显刺激蛋白聚糖和Ⅰ型胶原表达。Gaetani等〔36〕呈现的数据提示在基质合成和三维细胞组织中，人类NP细胞和ADSCs共培养能增加体外重构组织的质量。另一方面，细胞扩增的基本要求是达到移植的有效细胞数量，传统单层细胞培养方式存在一些不足，包括细胞的分化、衰老和基因突变〔33〕。ADSC的一大优点是可以在门诊病人身上通过微创方式轻易获取脂肪组织，周围组织ADSCs的含量可达到25 000/g。Minogue等〔38〕发现尽管MSCs和ADSCs都可以分化为NP细胞，但相对于MSCs而言，ADSC向NP分化的细胞表型与NP细胞相似性更高，因此更适合于NP组织工程。因此，在临床应用中，脂肪组织可以被认为是干细胞的合适来源，在获得程序上简易，细胞数量上达标。

4.3 NP的支架 当设计一个用于组织工程的支架时，需要考虑到许多因素，例如免疫原性、结构性和力学性能，生物相容性和生物降解性以及采用何种移植方法〔17〕，理想的组织工程支架材料应具备以下条件〔39〕:良好的组织相容性;具有可塑性，并有一定的机械强度;具有三维立体结构，一方面有利于细胞的植入黏附，另一方面有利于营养成分的渗入和细胞代谢产物的排出;此外，还应该具有较好的生物可降解性，在组织形成过程中逐渐分解，不影响新形成组织的结构和功能。目前已报道的有贝壳或羟基磷灰石贝壳、褐藻胶、蛋白聚糖/端胶原凝胶、透明质酸、磷酸钙、聚左旋-乳胶(PDLA)、去矿化骨基质(DBM)和小肠黏膜下层(SIS)〔11〕等。

随着微创手术的不断发展，在手术治疗以后应用注射型支架来增加NP组织含量已应用多年。自1974年硅胶第一次应用于IVD置换以来，已经发展出了很多注射用的生物材料，例如透明质酸，纤维蛋白，类弹性蛋白多肽，Ⅰ型胶原蛋白，Ⅱ型胶原蛋白褐藻胶和壳聚糖〔40，41〕。

壳聚糖，起源于部分解聚和去乙酰胆碱的壳质，是甲壳纲动物壳的主要组分，具有突出的生物学性能，如组织相容性，生物退变性和抗细菌活性。这些性能与它特殊的物理和化学组成相一致，使它成为骨科组织工程中一种多功能的生物高分子聚合物〔42〕。尤其是，作为一种凝胶制剂，它能够形成转换pH或温度的凝胶。已证实带有甘油磷酸或磷酸氢铵(AHP)的壳聚糖的组合能够产生一种热感应凝胶，在室温下是液体，在生理温度下为固体〔43，44〕。这种性能能够使壳聚糖凝胶用来IVD内注射。凝胶被推荐为一种理想的用来NP置换的候选支架材料，因为它们与天然组织机械性能相近〔45〕。目前已有两项研究提供了使用壳聚糖/甘油磷酸凝胶作为支架的证据，文献显示它们能维持牛的NP细胞的生存能力和功能〔46〕，进而在不同的培养基中〔47〕诱导人类MSCs向类NP细胞分化。

组织工程为NP退变的治疗提供了一个新的途径，这一技术已在临床治疗软骨损伤中得到应用。一般通过两种途径实现:(1)分离IVD细胞种植于基质，体外生长以达到需要的组分，然后移植到退变IVD中。(2)使用可降解的高分子聚合物附加于细胞上，将混合有高分子聚合物的细胞注射入IVD，在IVD中原位增殖〔48〕。NP再生的临床研究中显示，使用自体同源的IVD软骨细胞移植(ADCT)能明显减轻疼痛，寻找适合的载体将增强这一方法的治疗潜力〔49〕。因此，研究注射型支架是十分必要的。一些研究者已对NP细胞体外培养的培养环境和支架进行了大量研究。

自体同源软骨细胞移植法(ACT)用于治疗软骨疾病是一种越来越流行的方法。Gorensek等〔50〕将新西兰大白兔的NP从IVD中移出，替代以耳部软骨来源的软骨细胞。他们的研究显示耳部软骨来源的ACT能移植替代NP。Mizuno等〔51〕尝试重构混合性IVD结构，包含种植于PGA的AF和NP细胞，各自带有海藻支架，样本移植于无胸腺大鼠皮下。他们的研究显示，在临床应用中，创造一个带有与天然组织类似组成和力学性能的混合型IVD是可行的。

Hamilton等〔52〕研究了体外重建IVD三维结构的可能性，它包含NP和软骨终板和带孔钙磷酸盐替代性骨。牛关节软骨种植于带孔钙磷酸盐的表面，允许体外培养形成软骨和NP细胞放置于体外培养形成的透明软骨之上。它们的研究显示了生成复合结构的可能性，包含类终板软骨层，从而使替代IVD的骨组织界面间特性变得更好。IVD的组织工程使用MSCs诱导分化为IVD细胞表型，这已被认为是IVD退变治疗的可供选择之一。

成功的组织工程NP移植应该具有近似天然组织的功能。由于目前缺乏关于它们生物学表型的足够知识，NP细胞的特征仍需进一步明确。特定的细胞标记物如CD24、缺氧诱导因子-1(HIF-1)、葡萄糖输送因子-1(GLUT-1)、MMP-2、雕刻蛋白3(GPC3)和角蛋白 19(K19)被认为是有益的参考〔35，53～55〕，尤其是Risbud等〔35〕认为HIF-1α能作为髓核细胞的表型标记物，从而用于鉴定髓核细胞。

5 展望

NP组织工程提供了治疗人IVD退变的美好前景。但是，距离临床应用仍很遥远。至今大部分体内实验数据都是从鼠和犬类模型获得的。但在这些动物IVD内存在脊索细胞，有可能转变成NP细胞，而人类脊索细胞仅存在于胚胎期并且出生后很快消失，这在很大程度上限制了实验数据的应用。尽管体外动物实验种类较多，但是由于动物退变模型的营养情况好于人类 IVD，两者退变过程不一致，造模还是不能精确模拟人类IVD退变的过程，从而影响对退变机制的认知。

应用组织工程学方法，对退变NP进行干预，是为了延缓或逆转IVD退变，目前还处于研究的初期阶段。IVD中心区域无血供，营养差，移植的细胞存活问题较为突出，而注射到退变IVD内的细胞因子也不易发挥有效作用，因此如何解决退变IVD的营养供应有待于进一步研究。

通过组织工程学的方法，有机结合细胞移植、细胞因子及(或)转基因技术复合支架植入病变NP，修复甚至重塑NP，改善细胞外基质营养成分，增加NP含水量，恢复变窄、塌陷腰椎间隙，修复受损的纤维环裂口，改善软骨终板的营养供应，是NP组织工程研究的价值所在。

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